Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004株微型基因组的构建及其功能鉴定

目的本研究旨在构建Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004的微型基因组和辅助质粒,为构建病毒拯救体系奠定基础。方法根据Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004的全基因组序列,采用SOE方法将增强绿色荧光蛋白基因(eGFP)插入NDV08-004的3’-Leader和5’-Trailer区域之间后反向插入转录载体pOLTV5中,构建了NDV08-004的微型基因组pLGT-03。将pLGT-03转染辅助病毒NDV08-004感染的表达T7RNA聚合酶BSRT7/5细胞进行功能鉴定。采用RT-PCR将NDV08-004的NP、P和L蛋白基因亚克隆入表达载体pCI-neo中,分别构建了三个辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L。通过构建的微型基因组pLGT-03和三个辅助质粒按照一定的比例共转染BSRT7/5细胞来验证辅助质粒的功能。结果微型基因组pLGT-03转染辅助病毒感染的BSRT7/5细胞后可见明显荧光,表明微型基因组构建成功。微型基因组和辅助质粒共转染可见荧光表达,表明三个辅助质粒均具有相应的功能。结论表明微型基因组和辅助质粒均具有相应的功能,为建立NDV08-004的反向遗传操作平台奠定了基础。

4株新出现的Ⅰ类新城疫病毒F基因的变异分析

为了分析我国新出现的Ⅰ类新城疫病毒的分布和分子特性,对2016年分离到的4株Ⅰ类新城疫病毒进行F基因序列分析和遗传进化分析。结果显示:4株Ⅰ类新城疫病毒F基因编码长度均为1 662nt,共编码553个氨基酸,分离株之间氨基酸相似性为97.9%~100%。4株分离株F蛋白裂解位点的氨基酸组成均为112 ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株的分子特征。F基因高变区(47—420nt)遗传进化分析结果显示这4株病毒为国内新出现的基因型,利用F基因编码区全长序列构建系统进化树显示4株病毒属于基因1c亚型,与北美分离株高度同源,而与国内基因1c亚型分离株(Duck/Guangxi/1261/2015)相似性仅为95.5%~97%。监测数据表明这种新出现的Ⅰ类新城疫病毒具有在国内进一步流行和扩散的风险。

Ⅰ类新城疫病毒分离株NDV08-046的基因组特性

对1株Ⅰ类新城疫病毒分离株NDV08-046进行了全基因组序列测定和遗传进化分析。结果表明,该分离株基因组长度为15198 nt,符合＂六碱基原则＂。与Ⅱ类新城疫病毒的基因组序列相比,该分离株在基因组P基因的2381~2382 nt的位置（根据La Sota株的基因组序列,包含15186 nt）有12 nt的插入（TGGGAGACGGGG）。NDV08-046株F蛋白裂解位点的序列为112-ERQERL-117,具有典型的新城疫弱毒株特征。全基因组的遗传进化分析显示,所有的新城疫毒株能够被分为2个明显不同的分支,即Ⅰ类和Ⅱ类,NDV08-046分离株在分类地位上属于Ⅰ类新城疫病毒基因2型。

Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004株病毒拯救体系的建立

根据Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004基因组序列(GenBank登录号FJ794269),设计7对引物,采用RT-PCR将NDV08-004基因组分段扩增(片段A～G)并分别克隆入pGEM-Teasy载体,然后采用单一的酶切位点将7个片段依次亚克隆到转录载体pOLTV5中,构建了含NDV08-004全基因组cDNA的转录载体NDV08-004-pO。采用构建的三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)与基因组NDV08-004-pO按照2:1:1:2的比例共转染BSR T7/5细胞,结果成功拯救出具有血凝性的NDV08-004,初代分离物血凝价为4.33log2±0.58。Ⅰ类NDV反向遗传操作体系的建立为开展Ⅰ类NDV的致病机制奠定了基础。

2016—2019年我国Ⅰ类新城疫病原学监测与遗传进化分析

为掌握我国Ⅰ类新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的分布及分子演化特征,2016—2019年,随机从国内23个省(自治区、直辖市)998个采样点,采集家禽口咽/泄殖腔双拭子样本、野鸟粪便样本和环境样本共45 458份,通过病毒分离和RT-PCR鉴定,共分离到Ⅰ类NDV 558株。从时间分布看,2016—2019年Ⅰ类NDV分离率分别为0.95%、0.89%、1.88%和1.37%,有增高趋势;从地理分布看,我国16个省(自治区、直辖市)分离到Ⅰ类NDV,主要集中于华东、西南和西北地区;从场点分布看,活禽批发市场和农贸市场的Ⅰ类NDV阳性率明显高于养殖场和屠宰场;从宿主分布看,Ⅰ类NDV主要来源于鸡和鸭,少量来自鹅、鸽和环境样本;从基因型分布看,558株Ⅰ类NDV属于2个基因亚型,其中1.1.2亚型为近年来我国流行的主要基因亚型。研究表明,我国Ⅰ类NDV污染面广,宿主范围广泛,且存在2种基因亚型。研究提示,应加强Ⅰ类NDV的免疫、监测,同时加强饲养管理,提高家禽抵抗力,降低病毒基因变异致毒力增强的风险。本研究为我国科学防控新城疫提供了参考数据。

2011～2015年中国Ⅰ类新城疫病原学监测与遗传进化分析

为了研究Ⅰ类新城疫病毒在中国的分布及分子演化特征,2011~2015年按照《国家动物疫病监测与流行病学调查计划》,随机从国内26个省市945个采样点共采集家禽口咽、泄殖腔拭子及环境样本53 176份,通过病毒分离和RT-PCR对中国I类新城疫病毒的分布和分子特征进行了调查分析。结果显示,2011~2015年共分离到I类新城疫病毒1 472株,其中,2011年病毒分离率最高,随后病毒分离率有所下降;Ⅰ类新城疫病毒分布范围广,在中国22个省市均分离到病毒,病毒主要分布于华东、华中、华南和西南地区;活禽批发市场和农贸市场的I类新城疫阳性率明显高于养殖场和屠宰场;分离株主要来源于鸡(1 182株),鸭、鹅、鸽子和环境样本中也存在I类新城疫病毒;所有分离株可划分为3个基因型(1~3型),其中基因3型为近年来中国流行的主要基因型。