MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A(MICA)的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系。方法采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学检测MICA在该细胞中的表达。结果通过PCR技术获取了MICA基因并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中为过表达。结论 pEGFP-N1-MICA真核表达载体的成功构建与稳定转染Tca8113-Tb细胞系的建立,为进一步研究该基因的功能奠定了良好的实验基础。

肾移植受者术前主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A抗体对移植后早期急性排斥反应的影响

目的探讨肾移植受者术前主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A（MICA）抗体对肾移植术后早期急性排斥反应和移植肾功能恢复的影响。方法检测2009年~2010年本院197例未使用免疫抑制剂的肾移植受者术前MICA抗体及其特异性,随访其后接受尸体肾移植手术的139例受者的术后早期急性排斥反应（AR）和移植肾功能。结果 197例肾移植受者术前MICA抗体阳性45例（22.84%）。MICA抗体特异性分析发现有11种抗体,其中出现频率最高的是抗MICA019（占65.7%）,出现频率最低的是抗MICA015（占8.6%）和抗MICA017（占8.6%）,高、低频率抗体间的差异具有显著性（χ2=24.48,P〈0.01）。45例阳性受者中单一特异性抗体18例（占51.4%）,多种特异性抗体17例（占48.6%）。197例受者中139例在术后有39例发生早期AR（占28.1%）;其中,45例术前MICA抗体阳性受者中38例接受移植后有14例发生早期AR（占36.8%）;152例术前MICA抗体阴性受者中有101例接受移植后有25例发生了早期AR（占24.8%）。结论中国人群中最常见的MICA抗体中为抗MICA019,推测MICA019为中国人群中较常见基因是其表现出临床上高频率抗体的原因。

肾癌患者血清中可溶性人类主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关基因A蛋白的表达和临床意义

目的探讨血清中可溶性人类主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关基因A蛋白(sMICA)检测对肾癌患者的临床诊断价值。方法应用酶联免疫吸附试验测定40例肾癌患者(肾癌组)手术前后和40名健康者(对照组)的血清sMICA水平,并对血清sMICA水平与临床特征的关系进行分析。结果肾癌组术前的血清sMICA水平为(366.15±27.89)pg/mL,显著高于对照组的(214.03±22.15)pg/mL(P<0.01)。肾癌组术后的血清sMICA水平为(229.18±45.54)pg/mL,显著低于术前水平(P<0.01),与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期肾癌患者的血清sMICA水平为(443.79±27.21)pg/mL,显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者的(310.68±40.93)pg/mL(P<0.05),而男性与女性患者间、<65岁与≥65岁患者间血清sMlCA水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论血清sMICA水平可作为肾癌的一个辅助诊断指标,且其与肾癌患者的免疫功能状态和临床分期有一定的关系。

湖南地区白血病MHC-Ⅰ类链相关基因A微卫星多态性分析

目的:探讨MHC-Ⅰ类相关链基因A(MHC class-Ⅰchain related gene A,MICA)与湖南地区白血病之间的相关性。方法:应用荧光聚合酶链反应-基因扫描技术和聚合酶链反应-序列特异性引物技术分析,对62例白血病患者和112名正常人群进行MICA基因第5外显子微卫星等位基因分型及MICA基因缺失检测。结果:慢性粒细胞白血病组(n=35)的MICA*A5基因频率显著低于正常对照组(RR=0.635,P=0.0380);急性淋巴细胞性白血病组(n=13)的MICA*A4基因频率显著低于正常对照组(RR=0.120,P=0.0297);而在急性非淋巴细胞性白血病组(n=14),MICA*A5基因频率显著高于正常对照组(RR=2.229,P=0.0218)。结论:本文数据显示,MICA-STR多态性与湖南地区白血病之间存在相关性;不同病理类型的白血病相关格局有所不同。

湖南地区鼻咽癌MHC-Ⅰ类链相关基因A第5外显子微卫星多态性研究

目的研究MHCⅠ类链相关基因A(MHCclassⅠchainrelatedgeneA,MICA)第5外显子微卫星多态性与湖南地区鼻咽癌之间的相关性。方法应用荧光聚合酶链反应基因扫描技术和聚合酶链反应序列特异性引物技术分析127例湖南地区鼻咽癌患者和112名正常人群MICA基因第5外显子微卫星等位基因及MICA基因缺失(MICADel)频率。结果MICAA9表型频率在患者组(45/127)高于对照组(20/112),相对风险值(relativerisk)为2.524(P=0.001,Pc=0.006);MICAA5.1表型频率在患者组(51/127)低于对照组(69/112),相对风险值为0.418(P=0.0004,Pc=0.0026)。进一步分析发现,MICAA9在男性患者组的表型频率(35/101)高于男性对照组(11/78),相对风险值为3.23(P=0.00095,Pc=0.006);MICAA5.1在男性患者组的表型频率(39/101)低于男性对照组(49/78),相对风险值为0.372(P=0.0007,Pc=0.004);各MICASTR等位基因频率在女性患者组与女性对照组之间的差异无统计学意义(Pc>0.05)。结论湖南地区MICASTR等位基因多态性与鼻咽癌相关,MICAA9是该人群男性个体的一个鼻咽癌遗传易感标记。

乙型肝炎病毒全基因转染L02细胞模型的建立及其HLA-A,B,C和MHCⅠ类链相关基因A／B分子的表达

目的 以双拷贝HBV全基因质粒pEcob6转染非癌性肝源细胞株L02细胞建立有HBV分泌的细胞转染模型,通过检测细胞表面HLA-A,B,C及MHC Ⅰ类链相关基因（MIC）A／B分子,分析HBV对肝细胞HLA-A,B,C和MICA／B表达的影响。方法 用EcoRⅠ酶切掉pEcob6的HBV基因并连接,构建无HBV基因的对照空质粒;用脂质体法以pEcob6或空质粒与pcDNA3．1-neo-共转染L02细胞株,筛选抗性细胞株并稳定传代;用Abbott EIA试剂和免疫荧光法检测细胞上清液和（或）细胞的HBsAg、HBcAg和HBeAg表达,实时荧光定量PCR检测HBV DNA含量;用流式细胞仪检测细胞表面HLA-A,B,C和MICA／B分子的表达,分析两种分子表达的变化。结果 经G418抗性克隆筛选,pEcob6稳定转染细胞株（L02-HBV）的上清液HBsAg和HBeAg可达24．78 （S／N）和4．117（S／N）,HBV DNA为9．67×10^4拷贝／ml;而对照空质粒转染细胞株（L02 mock）和L02的表达均为阴性。共聚焦显微镜观察,L02-HBV细胞内的HBsAg强表达于细胞质内,而HBcAg弱表达于胞核或胞质内。流式细胞检测结果显示,L02和L02-mock细胞有HLA-A,B, C的表达,基本无MICA／B的表达,L02-HBV细胞HLA-A,B,C和MICA／B的表达均增强,差歼有统计学意义（P〈0．05）。结论 以HBV全基因质粒转染L02细胞经筛选、克隆、传代,可获得有HBV相关抗原表达及HBV DNA分泌的细胞模型。HBV基因的转录或复制可增强肝细胞株L02的HLA-A-A,B,C及MICA／B的表达,可能与肝细胞的免疫损伤有关。

江苏人群MICA基因多态性与乙型肝炎源性肝癌的相关性研究

目的探讨江苏人群主要组织相容性复合体-Ⅰ类链相关基因A（MICA）基因多态性分布情况及其与乙型肝炎源性肝癌的关系。方法乙型肝炎源性肝癌组161例患者,健康对照组162例健康体检者,应用聚合酶链反应测序方法进行基因分型。比较各基因型等位基因频率分布及与乙型肝炎源性肝癌的关系。结果受试者携带GG基因型比携带AA基因型患乙型肝炎源性肝癌的风险高[比值比（OR）：1.860,95%置信区间（95%CI）：1.009-3.428,P=0.020],或至少携带1个G等位基因的受试者比携带A等位基因的受试者更易患乙型肝炎源性肝癌（OR：1.412,95%CI：1.030-1.936,P=0.046）。GG基因型患者血清MICA水平[（89.1±41.7）pg/mL]明显高于AA基因型[（18.2±9.5）pg/mL]和AG基因型[（35.8±17.4）pg/mL]。结论江苏人群MICA基因多态性（rs2596542）与乙型肝炎源性肝癌相关。

MICA第5外显子微卫星多态性与大肠癌易感相关性研究

目的研究MHC-Ⅰ类链相关基因A(MICA)第5外显子微卫星多态性与大肠癌之间的相关性。方法应用荧光PCR微卫星分型技术分析103名大肠癌患者和100名正常人群MICA基因第5外显子微卫星等位基因频率。结果 MICA*A6基因频率在患者组(23.3%)高于对照组(14.5%),相对风险(OR)为1.791 4(P<0.05);其余各基因频率在患者组与对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MICA-STR MICA*A6等位基因多态性与大肠癌相关,MICA*A6是人群个体中1个大肠癌遗传易感标记。

MICA＊A5．1与沙眼衣原体感染的相关性

目的研究MICA＊A5．1基因与沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）感染的关系。方法聚合酶链反应（P（R）-SSP检测样本中的MICA＊A5．1基因，荧光定量-聚合酶链反应（FQ-PCR）检测Ct-DNA。结果在122例不孕患者组中有33例Ct感染阳性，140例对照组中有16例Ct感染阳性，2组Ct感染率分别为27．1％和11．4％。经PCR-SSP方法检测，不孕患者组中MICA＊A5．1基因阳性个体有35例，ct感染阳性且同时MICA^＋A5．1基因阳性的个体有5例；对照组中MICA＊A5．1基因阳性个体有43例，Ct感染阳性且同时MICA＊A5．1基因阳性的个体有1例。MICA。A5．1基因阳性个体和MICA＊A5．1基因阴性个体之间Ct感染率的差异具有统计学意义（不孕患者组P=0．046；对照组P=0．022；两组合并P=0．01）。结论不孕患者组Ct感染率要高于对照组；与MICA＊A5．1基因阴性个体相比，MICA＊A5．1基因阳性个体的Ct感染率较低。

北方汉族MICA基因遗传多态性及与HLA-B连锁不平衡研究

目的 了解MICA等位基因在中国北方汉族的分布及与HLA-B基因型的连锁关系。方法 用直接测序法对北方汉族224个标本的HLA-B和MICA基因的2—6外显子进行测序。用Arlequin软件统计分析2个位点间的连锁关系。结果 发现18个MICA的等位基因,其中MICA~*002(16.07%),MICA~*008(23.21%)和MICA~*010(21.65%)最为常见。MICA~*010-HLA-B~*46∶01,MICA~*045-HLA-B~*13∶01,MICA~*049-HLA-B~*51∶01有明显的连锁关系。结论 北方汉族人群呈现特异MICA等位基因库,MICA与HLA-B具有连锁关系。

不同分化程度的肝细胞癌患者血清可溶性MICA水平及MICA等位基因多态性分析

目的研究肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清可溶性MICA(soluble MHC class-Ⅰchain related gene A,sMICA)水平及MICA等位基因多态性与HCC分化程度的关系,为HCC的预防和治疗提供新的思路。方法按照Edmondson-Steiner四级(Ⅰ-Ⅳ)分级法将113例HCC患者分为高分化(Ⅰ-Ⅱ级)组(n=74)和低分化(Ⅲ-Ⅳ级)组(n=39),同时招募80例无亲缘关系的健康志愿者作为正常对照。收集对照组和HCC患者的外周血,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清sMICA水平,采用聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)对各组MICA等位基因进行测序分型。结果HCC组血清ALT、AST、AFP、sMICA的浓度高于对照组(P<0.001)。HCC低分化组的血清sMICA浓度高于HCC高分化组(P=0.007),HCC高分化组和低分化组的血清ALT、AST、AFP浓度差异无统计学意义(P>0.05)。MICA-A4在HCC组的频率(11.5%)明显低于对照组(23.1%)(Pc=0.01),而MICA-A5在HCC组的频率(48.2%)则高于对照组(34.4%)(Pc=0.03),但MICA-A4、MICA-A5在HCC高分化组与低分化组的分布频率无明显差异(Pc值分别为0.67、0.31)。MICA*010在HCC组的频率(36.7%)明显高于对照组(15.6%)(Pc<0.001),而MICA*045在HCC组的频率(3.1%)低于对照组(13.1%)(Pc<0.001),但MICA*010、MICA*045在HCC高分化组与低分化组的分布频率差异无统计学意义(Pc值分别为0.28、0.42)。结论血清sMICA水平可作为HCC恶性程度的一种重要标志,MICA-A5和MICA*010可能是HCC的一个易感因素,MICA-A4和MICA*045可能是HCC的一个保护因素。

丙戊酸钠诱导人肺癌细胞MICA表达上调增强NK细胞对其杀伤作用的研究

目的观察丙戊酸钠(valproic acid,VPA)对人肺癌细胞A549、SP-CA-1、NCI H446中的MHCⅠ类链相关基因A(MICA)表达的影响,并比较肺癌细胞经VPA处理前后NK细胞对其杀伤作用的差异。方法将0.75～12.0 mmol/L VPA作用于A549、SP-CA-1、NCI H446细胞,与未加VPA的对照组进行比较,观察VPA对人肺癌细胞生长的影响。选择对细胞生长无影响的1.50 mmol/L和3.00 mmol/L VPA诱导3株肺癌细胞4 d,通过RT-PCR反应和免疫荧光法分别检测MICA在mRNA和蛋白质水平的变化。LDH法检测VPA处理肺癌细胞前后其被NK细胞杀伤程度的变化。结果>6.0 mmol/L VPA对3株肺癌细胞均表现出抑制其生长。用1.50mmol/L和3.00 mmol/L VPA诱导4 d后的3株肺癌细胞,与对照组比较,其MICA的mRNA转录水平和蛋白质表达提高(P<0.05);1.50 mmol/L和3.00 mmol/L VPA诱导表达MICA后的肺癌细胞均比未经VPA处理的肺癌细胞被NK杀伤的程度高(P<0.05)。3.00 mmol/L VPA浓度组3株肺癌细胞的MICA mRNA、蛋白质表达水平及其被NK细胞杀伤的程度均高于1.50 mmol/L VPA浓度组(P<0.05)。结论VPA通过上调MICA抗肺癌作用的新机制,为肺癌临床免疫生物治疗提供了实验依据。

可溶性MICA抗原在湖南地区汉族恶性肿瘤患者血清中的分布及临床意义

目的研究湖南地区汉族人群中可溶性MHCⅠ类链相关基因A(sMICA)分子在恶性肿瘤中的分布及诊断价值。方法双抗体夹心法检测512例恶性肿瘤患者和141例正常对照血清中sMICA浓度含量,分析sMICA含量在不同疾病中含量变化及其与疾病的相关性。结果 sMICA含量在恶性肿瘤中只有肝癌有诊断价值(AUC=0.843),而其他恶性肿瘤的诊断价值意义不大。肝癌患者血清中的sMICA含量最高,为743.4±304.1pg/mL(P=0.003),明显高于其他恶性肿瘤,胃癌次之,最差的为女性生殖系统肿瘤和恶性淋巴瘤,分别为162.5±116.1 pg/mL(P=0.115)和140.9±137.6 pg/mL(P=0.205)。结论肝癌患者血清sMICA含量明显增加,sMICA含量可应用于肝癌的诊断,而对其他恶性肿瘤的诊断价值意义不大。

MICA微卫星等位基因A5．1与天津汉族LADA相关

通过PCR扩增后行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)组100例和正常对照组145名的组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A(MICA)(GCT)_n多态性,发现LADA组最高等位基因频率是A5.1,为0.340,高于正常对照组的0.183(P<0.05),提示MICA等位基因A5.1与天津汉族LADA相关联。

不同程度低氧对体外培养人胃粘膜上皮细胞株GES-1中MICA表达的影响

目的研究不同程度低氧对体外培养人胃粘膜上皮细胞株GES-1中MICA基因表达的影响。方法建立GES-1细胞体外低氧培养模型。采用RT-PCR和免疫细胞化学技术分别检测模型MICA基因和蛋白的表达变化。结果在缺氧环境下培养0、48和72 h后MICA蛋白表达(57.67±2.30、96.14±1.75、259.59±3.51)及mRNA/β-actin比值(0.22±0.03、0.37±0.02、0.68±0.03)都随缺氧时间不同表达量存在差别(P<0.05),且表达量随缺氧时间延长而升高,直线相关分析显示二者表达呈显著正相关。结论低氧可以刺激胃上皮细胞株GES-1中MICA基因的表达量显著增加。

丙戊酸钠在体内外影响NK细胞对人肺癌细胞杀伤作用的研究

目的观察丙戊酸钠(valproic acid,VPA)对人肺癌细胞A549、SP-CA-1、NCIH446中的MHCⅠ类链相关基因A(MICA)表达的影响,并比较经VPA处理前后NK细胞对肺癌细胞杀伤作用的差异,及肺癌荷瘤小鼠动物模型瘤组织重量、大小的差异。方法将0.75～12.0mmol/L VPA作用于A549、SP-CA-1、NCIH446细胞,与未加VPA的对照组进行比较,观察VPA对人肺癌细胞生长的影响。选择对细胞生长无影响的1.50mmol/L和3.00mmol/L VPA诱导三株肺癌细胞4d,通过RT-PCR反应检测MICA在mRNA水平的变化。LDH法检测VPA处理肺癌细胞前后其被NK细胞杀伤程度的变化。建立肺癌荷瘤小鼠动物模型,加入不同剂量VPA,体内观察VPA对肺癌瘤组织重量、大小的影响。结果用1.50mmol/L和3.00mmol/L VPA诱导4d后的三株肺癌细胞,与对照组比较,其MICA的mRNA转录水平提高,被NK杀伤的程度提高(P<0.05);高VPA浓度组三株肺癌细胞的mRNA水平及其被NK细胞杀伤的程度均高于低浓度组(P<0.05);VPA高剂量和/或低剂量组抑制荷瘤鼠皮下肿瘤的生长作用与对照组差异有统计学意义,P<0.05,抑瘤率分别为52.9%和35.9%。结论 VPA通过上调MICA抗肺癌作用的新机制,为肺癌临床免疫生物治疗提供了实验依据,具有治疗肺癌的潜在价值,VPA在体内对肺癌细胞A549的增殖也存在明显的抑制作用,为探讨肺癌治疗新方法及其机制提供一个新途径。

MICA反应性Vδ1γδT细胞对上皮肿瘤细胞的细胞毒作用

目的研究人类MHCⅠ类链相关基因A(MICA)是否可以在体外诱导Vδ1γδT细胞的扩增,并且对MICA反应性Vδ1γδT细胞的细胞毒作用进行初步研究。方法采用分子克隆技术原核表达并纯化MICA蛋白,使用重组MICA蛋白在体外诱导肿瘤组织中的Vδ1γδ肿瘤浸润T淋巴细胞(TILs),3-(4,5-二甲基噻唑-乙-YL)-2,5-二甲基-四唑溴盐(MTT)法检测MICA反应性Vδ1γδTILs的细胞毒活性。结果原核表达系统pET30表达并纯化了MICA;固相化的MICA蛋白可以诱导肿瘤组织中的Vδ1γδTILs在体外扩增,同时Vδ1γδTILs对MICA+的肿瘤细胞具有明显杀伤活性。结论MICA反应性Vδ1γδT细胞可能是肿瘤过继免疫治疗的新的候选效应细胞。

MICA-A5.1基因突变对乙型肝炎相关肝癌患者预后的影响及机制研究

目的探讨MHC-Ⅰ类链相关基因A-A5.1(MICA-A5.1)对乙型肝炎相关肝癌患者预后的影响及相关机制研究。方法选取2013年1月-2015年1月期间在南阳市中心医院住院治疗的196例乙型肝炎相关肝癌患者为研究对象,对所有患者术后进行160个月随访。分析MICA-A5.1基因与乙型肝炎相关肝癌患者临床病理特征的关系;应用Transwell实验分析乙型肝炎相关肝癌患者肿瘤细胞的侵袭能力;利用流式细胞术检测乙型肝炎相关肝癌患者肿瘤细胞凋亡情况;用Kaplan-Meier法分析携带与未携带MICA-A5.1基因的乙肝肝癌患者生存曲线。结果MICA-A5.1基因与乙型肝炎相关肝癌患者TNM分期、肿瘤大小、病理分化程度有关(χ^(2)=6.716、18.463、5.431,P<0.05)。携带MICA-A5.1基因的乙型肝炎相关肝癌患者的累积生存率显著低于未携带MICA-A5.1基因患者(0%vs.14.3%),差异有统计学意义(χ^(2)=11.800,P<0.05)。与未携带MICA-A5.1基因患者肿瘤细胞相比,携带MICA-A5.1基因的乙型肝炎相关肝癌患者肿瘤细胞侵袭率较高[(17.54±2.63)%vs.(48.23±5.91)%],差异有统计学意义(t=44.390,P<0.05),凋亡率较低[(32.41±2.74)%vs.(18.74±2.16)%],差异有统计学意义(t=39.052,P<0.05)。结论携带MICA-A5.1基因的乙型肝炎相关肝癌患者病情较重,肿瘤细胞恶性程度较高,且预后较差,提示MICA-A5.1基因可能与乙型肝炎相关肝癌患者病情进展及预后密切相关。

miR-17-5p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性

目的:探讨miR-17-5p在HCC细胞系HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性中的调控作用。方法:使用含野生型MICB基因3'UTR序列、突变型MICB基因3'UTR序列、miR-17-5p mimic序列、miR-17-5p-NC序列、anti-miR-17-5p序列的质粒载体分别或共转染HCC细胞系HepG2,使用丙戊酸钠处理转染或未转染细胞。应用荧光素酶活性测定检测miR-17-5p对MICB的调控作用。应用实时荧光定量PCR检测细胞或组织中miR-17-5p及MICB mRNA表达情况,利用蛋白免疫印迹法检测MICB蛋白表达情况。对比转染质粒后各组细胞中miR-17-5p和MICB mRNA及蛋白的表达情况,分析Target Scan预测和荧光素酶活性测定结果、miR-17-5p与MICB蛋白在HCC组织中的表达及与临床病理特征的关系、miR-17-5p与MICB蛋白在HCC组织中表达的相关性,并对比各组MICB蛋白表达和NK细胞介导的细胞毒性、丙戊酸钠各组NK细胞毒性。结果:①与miR-17-5p-NC组相比,miR-17-5p-mimic组HepG2细胞中miR-17-5p表达水平较高,MICB mRNA和蛋白表达水平均较低(P <0. 05);与anti-miR-17-5p-NC组相比,anti-miR-17-5p组HepG2细胞中miR-17-5p表达水平均较低,MICB mRNA和蛋白表达水平均较高(P <0. 05);与miR-17-5p-NC+MICB 3'UTR-Wt组相比,miR-17-5p-mimic+MICB 3'-UTR-Wt组荧光素酶活性较低(P <0. 05)。miR-17-5p-NC+MICB 3'UTR-Mut组与miR-17-mimic+MICB 3'-UTR-Mut组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P> 0. 05)。②与对应癌旁非肿瘤组织相比,miR-17-5p在HCC组织中的表达水平较高,而MICB蛋白表达水平较低(P <0. 05)。miR-17-5p和MICB蛋白的表达与肿瘤直径、远处转移、TNM分期、分化程度等临床病理特征有关(P <0. 05)。在HCC肿瘤组织中miR-17-5p与MICB蛋白表达水平呈明显负相关(P <0. 05)。③与miR-17-5p-NC组相比,miR-17-5p-mimic组NK细胞毒性、MICB蛋白表达水平均较低(P <0. 05);与miR-17-5p-mimic+MICB 3'UTR-Mut组相比,miR-17-5p-mimic+MICB-3'UTR-Wt共转染组中NK细胞毒性和MICB蛋白表达水平均较高(P <0. 05);与anti-miR-17-5p-NC组相比,anti-miR-17-5p组NK细胞毒性和MIBC蛋白表达均较高(P <0. 05)。④与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC组相比,丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic组细胞中MICB表达水平较低(P <0. 05)。在不同效靶比时,与Ctrl组相比,丙戊酸钠组NK细胞毒性较高(P <0. 05)。与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC组相比,丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic组NK细胞毒性较低(P <0. 05)。结论:miR-17-5p通过靶向MICB降低Hep G2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性,从而抑制NK细胞对肝癌细胞的毒性。

miR-17-5p靶向MICB减弱NK细胞对肝癌细胞的毒性作用

目的:探讨miR-17-5p在肝细胞癌(HCC)HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性中的调控作用。方法:使用含野生型MICB基因3'UTR序列、突变型MICB基因3'UTR序列、miR-17-5p mimic序列、miR-17-5p-NC序列、anti-miR-17-5p序列的质粒载体分别或共转染HCC HepG2细胞,使用丙戊酸钠处理转染或未转染细胞。应用荧光素酶活性测定检测miR-17-5p对MICB的调控作用。应用实时荧光定量PCR或蛋白免疫印迹检测细胞或组织中miR-17-5p及MICB mRNA和蛋白表达情况。结果:(1)与miR-17-5p-NC组相比,miR-17-5p-mimic组HepG2细胞中miR-17-5p表达水平显著升高,MICB mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0. 05);与anti-miR-17-5p-NC组相比,anti-miR-17-5p组HepG2细胞中miR-17-5p表达水平均显著降低,MICB mRNA和蛋白表达水平均显著增加(P<0. 05)。与miR-17-5p-NC+MICB 3'UTR-Wt组相比,miR-17-5p-mimic+MICB 3'-UTR-Wt组荧光素酶活性显著降低(P<0. 05)。miR-17-5p-NC+MICB 3'UTR-Mut组与miR-17-mimic+MICB 3'-UTR-Mut组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0. 05)。(2)与对应癌旁非肿瘤组织相比,miR-17-5p在HCC组织中的表达水平显著增加,而MICB蛋白表达水平显著降低(P<0. 05)。miR-17-5p和MICB蛋白的表达与肿瘤直径、远处转移、TNM分期、分化程度等临床病理特征有关(P<0. 05)。在HCC肿瘤组织中miR-17-5p与MICB蛋白表达水平呈明显负相关(P<0. 05)。(3)与miR-17-5p-NC组相比,miR-17-5p-mimic组MICB蛋白表达水平均显著降低(P<0. 05)。与miR-17-5p-mimic+MICB 3'UTR-Mut组相比,miR-17-5p-mimic+MICB-3'UTR-Wt共转染组中NK细胞毒性和MICB蛋白表达水平均显著增加(P均<0. 05)。与antimiR-17-5p-NC组相比,anti-miR-17组NK细胞毒性和MICB蛋白表达水平均显著增加(P均<0. 05)。(4)与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC组相比,丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic组细胞中MICB表达水平显著降低(P<0. 05)。在不同效靶比时,与Ctrl组相比,丙戊酸钠组NK细胞毒性显著增加(P<0. 05)。与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC组相比,丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic组NK细胞毒性显著降低(P<0. 05)。结论:miR-17-5p通过靶向MICB降低HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性,从而抑制NK细胞对肝癌细胞的毒性。