空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示:建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数(CV)均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。

猪博卡病毒1/2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速和高通量检测猪博卡病毒(PBoV)的方法,本研究根据GenBank中登录的PBoV 1/2型NS1基因高度同源保守序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测PBoV1/2的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法对常见的其它病毒均未检测到荧光信号,而仅对PBoV1/2检测为阳性;其灵敏度为45拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;组内和组间变异系数均小于5%。本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,为PBoV的早期诊断和定量分析PBoV感染程度提供参考。

新型阿卡斑病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒(AKAV)的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测2019年6-10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR最佳反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0μL,上、下游引物(4μmol/L)各1.0μL,标准品或反转录产物2.0μL,双蒸水补齐至20.0μL。扩增程序:95℃预变性30 s;95℃30 s,64℃(S基因)/66℃(M基因)30 s,72℃30 s,进行40个循环。SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因和M基因的极限为1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数(CV)均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。

BVDV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法与RT-PCR方法的建立与应用

利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。

检测猪圆环病毒2型SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计PCR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。多次试验证明,该方法具有良好的重复性。同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法检测猪流感H3N2亚型病毒方法的建立

本试验针对H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因建立SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测方法。根据GenBank上的SIV N2基因序列设计一对引物,扩增片段406bp。纯化扩增目的片段后连接pMD18-T载体中,命名为pMD18-TN2,转化入E.coli DH5α,测序正确作为阳性模板,优化反应条件建立方法。此荧光PCR方法所能检测最低病毒含量为75copies/μL,拥有良好的特异性和重复性。此方法的建立将为流感病毒N2亚型神经氨酸酶基因定型检测提供一种有效方法。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测肾移植患者IL-2和IL-10基因表达

目的对比肾移植患者和常规手术患者免疫状态,验证以β-actin mRNA为模板参照定量PCR技术的有效性。方法采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对29例肾移植患者和10例常规手术患者术前、术后3和7天外周血淋巴细胞IL-2和IL-10 mRNA表达进行检测。结果两组术前IL-2和IL-10 mRNA水平无差别;术后肾移植组IL-2mRNA明显降低,而对照组无明显变化;两组术后第3天IL-10 mRNA表达水平均明显升高,肾移植组高于对照组(P<0.01),术后第7天对照组降至正常,肾移植组亦下降,但水平仍高于术前。结论SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术对于监测肾移植患者免疫状况和研究免疫耐受意义重大,以β-actin mRNA为模板参照的定量PCR技术是测定细胞因子基因表达的简单有效方法。

鉴别犬瘟热病毒强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据Gen Bank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献,选择M基因保守区域合成了1对通用引物M1/M4及鉴别犬瘟热强弱毒株的特异引物M2和M3。试验证明,该方法重复性良好;检测强弱毒株的最低检出限度在10拷贝;对新城疫病毒、水貂肠炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬细小病毒5种病毒的特异性检测均为阴性;对175份犬瘟热疑似病料进行荧光定量RT-PCR,检出127份阳性样品,其中强毒株98份,弱毒疫苗株29份,常规RT-PCR检出112份阳性样品。结果表明,该方法的敏感性高于常规RT-PCR检测,并能有效的鉴别强弱毒株。

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10~4~5.474×10^(9)拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R^(2)=0.9993。该方法最低检测限为5.747×10^(2)拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R^(2)=0.9854。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。方法设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。结果建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病(P<0.05),而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降(P<0.05)。结论 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类风湿关节炎患者血清miR-146a的表达及意义

目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎（RA）患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例（活动期30例、缓解期18例）、骨性关节炎（OA）患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平,并进行ROC曲线分析;对各组进行红细胞沉降率（ESR）检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果表明,活动期RA患者血清miR-146a水平为（2.42±0.75）,显著高于缓解期RA患者（1.66±0.29）、OA患者（1.12±0.43）和体检健康者（1.01±0.34）,差异均有统计学意义（P均〈0.05）;miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积（AUCROC）为0.914（95%CI：0.872~0.926）;以1.96为cut off值,敏感性为95.0%、特异性为87.5%、准确性为91.9%。活动期RA组ESR为（37.5±5.2）mm/h,缓解期RA组为（14.4±4.7）mm/h,OA组为（11.6±5.1）mm/h,健康对照组为（9.6±3.9）mm/h,各组间差异有统计学意义（F=177.01,P〈0.01）。结论建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可用于RA患者血清miR-146a的检测。miR-146a可用于诊断活动期RA。

猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测试剂盒的研制

根据Gen Bank中猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的序列设计1对特异性引物,扩增出floR基因片段,克隆到p MD-18T载体上,构建p MD-18T-floR阳性标准质粒。通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化、荧光定量PCR标准曲线的建立、熔解曲线的分析及敏感性、特异性、重复性试验,建立针对猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的荧光定量PCR检测方法,并研制出检测试剂盒,同时对从养殖场分离的156株大肠杆菌进行耐药表型和耐药基因检测。结果显示,研制的试剂盒灵敏度可达1.0×101拷贝,重复性好,特异性强,对大肠杆菌磺胺类耐药菌株、β-内酰胺类耐药菌株、大环内酯类耐药菌株检测均为阴性,熔解曲线分析,扩增产物的熔解温度为88.8~89.2℃,没有引物二聚体和非特异性扩增峰出现,耐药表型与耐药基因检测符合率为96.7%。表明研制的试剂盒适合于临床样品猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因的检测。

猪丹毒丝菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、 敏感的猪丹毒丝菌检测方法, 本试验将猪丹毒丝菌的 grol 基因与载体TA/ Blunt- Zero 相结合构建重组质粒,以该重组质粒 DNA 为模板,筛选最佳反应条件,建 立 SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 检测方法,并对该方法进行灵敏度、特异性和重复性测定。 结果表明,本研究建立的检测方法对在 2×10^(2)~2×10^(9)copies/ μL 浓度范围内的质粒标准品有良好的线性关系, 线性相关系数 R^(2)=0.999 5,标准曲线为 y=-3.231x+41.834,未见非特异性扩增。 该方法对质粒标准品最低检测浓度为 20 copies/ μL,敏感度比普通 PCR 提高了 1 000 倍。 用该方法检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、猪链球菌 3 型(Ss3)、猪链球菌 2型(Ss2)、大肠杆菌(E.coli)、沙门菌(Salmonella)和多杀性巴氏杆菌(Pm)时,检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。重复试验结果显示,组内和组间的变异系数均小于 2%,表明该方法具有良好的重复性。运用本试验建立的方法对 20 株疑似猪丹毒丝菌临床样品进行检测,阳性检出率为 60%,高于普通 PCR 检出率(50%)。 综上,本试验建立的检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,适合临床上快速诊断丹毒丝菌。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

禽源沙门氏菌荧光定量PCR方法的构建及应用

试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法,本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物,分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并对2种方法进行了综合比较。结果显示,TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10^(1) copies/μL和1.0×10^(2) copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性;重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品,2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明,2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。

猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

猪圆环病毒(PCV)包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)。近些年来,PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染,因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR鉴别检测方法显得尤为必要。本试验通过特异性引物筛选,各项反应条件优化,建立了实时荧光定量PCR鉴别方法。结果表明:PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL。与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。批内及批间变异系数均小于1%。对98份PCV疑似阳性病料检测结果表明,PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%,共感染率为7.1%。该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR在布鲁氏菌快速检测中的应用研究

目的将SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术应用于布鲁氏菌的快速检测,为布鲁氏菌病(布病)的早期发现提供新的检测手段。方法将收集的布病急性期患者全血2份,慢性期患者全血8份和羊全血12份进行细菌分离培养,筛选疑似布鲁氏菌进行涂片镜检、噬菌体裂解试验,同时提取核酸,制备模板,利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术进行布鲁氏菌检测。结果共分离出4株疑似布鲁氏菌,其形态及染色特征与革兰阴性小杆菌相同。1、2、3号菌株噬菌体裂解试验BK2裂解,Tb不裂解,确定为羊种布鲁氏菌,4号噬菌体裂解试验阴性。除4号待测菌株和阴性对照EV76外,其他菌株的荧光定量PCR的熔解曲线在88℃左右出现特异性的吸收峰,证实是布鲁氏菌。结论SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术检测布鲁氏菌用时短,特异性强,重复性好,在布病的筛查和布鲁氏菌的快速检测中具有较好的推广应用价值。

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。

鸡烟曲霉菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡烟曲霉菌快速检测方法,根据GenBank已发表的benAfum基因序列设计1对特异性引物,建立了检测烟曲霉菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对烟曲霉菌分离株进行了检测。结果显示,该方法灵敏度高,对烟曲霉菌最低检出量为10 copies/L;重复性好,变异系数在0.7%~0.8%之间;特异性强,与黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉及白色念珠菌等病原菌无交叉反应;该方法操作简单、耗时短,只需2 h即可完成整个试验过程。上述结果表明,该方法可应用于烟曲霉菌感染的快速检测。