SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测脑胶质瘤中RASSF1A mRNA

目的 建立检测RASSF1A(RASassociationdomainfamily 1ARASSF1A)mRNA的SYBRGreenⅠ实时定量PCR的方法 ,了解脑胶质瘤中RASSF1A的表达水平 ,研究RASSF1AmRNA的表达和肿瘤恶性程度的关系。方法 构建克隆载体作为定量模板 ,RocheLightCycler 定量检测 4 8例不同恶性程度胶质瘤组织和 6例正常脑组织标本。结果 4 8例脑胶质瘤组织中有 5例未检出RASSF1AmRNA。与内参照三磷酸甘油醛脱氢酶基因GAPDH(glyceraldehycle 3 phosphatedehydrogenase,GAPDH)比较后 ,RASSF1AmRNA的表达范围从 0 .0 8～ 1.0 0 /μg ,均值为 (0 .5 0± 0 .0 0 4 ) /μg。 6例正常脑组织标本均有RASSF1AmRNA的表达 ,范围从 0 .70～ 1.80 /μg ,均值为 (1.0 5± 0 .0 8) /μg。各期胶质瘤中RASSF1A的mRNA的表达水平均低于正常脑组织 ,但胶质瘤不同病理级别组之间的差异无显著意义。结论 胶质瘤中RASSF1A的mRNA的表达水平均低于正常脑组织。成功地建立了SYBRGreenⅠ实时定量检测RASSF1A基因表达方法 ,为研究RASSF1A表达水平下调的机制、表达水平和肿瘤的恶性程度、转移。

微紫青霉CBHⅠ酶纤维素结合结构域在大肠杆菌中的分泌型表达及性质研究

为研究纤维素酶纤维素结合结构域的结构与功能 ,进而深入了解天然纤维素的生物降解机制和提高纤维素酶的生物工艺学价值 ,采用 PCR技术体外扩增了携带微紫青霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶 ( CBH ) CBD编码区的 DNA片段 ,将 CBD编码区 DNA片段插入带有 Erwiniacarotovora pe1 B前导肽序列的大肠杆菌质粒 p KK- tac- new上进行了表达 .携带微紫青霉 CBDCBH 编码区的大肠杆菌重组菌株 DH5α( p KK- tac- new- 8)产生有活性的分泌型 CBDCBH 蛋白 .SDS-PAGE检测显示所产生的 CBDCBH 蛋白分子量约 1 0 .8k D.在 IPTG诱导下 ,该菌株所产生的CBDCBH 蛋白含量达 45.2 mg/L,且 90 %以上的 CBD蛋白分泌到培养物上清液中 .结晶纤维素 CF-1 1溶液经 CBDCBH 处理后 ,浊度比对照提高了 1 2 8.9% ,天然棉花纤维结构经 CBDCBH 处理后产生一定程度的非水解性降解作用 ,表明微紫青霉 CBDCBH 具有解聚天然结晶纤维素的作用 .

C^n空间中的第Ⅰ型B-M积分表示的拓广

利用C^n中有界凸区域的第1型积分表示的拓广形式和第Ⅰ型的 Bochner-Martinelli公式,拓广了第Ⅰ型Bochner-Martinelli积分表示。已有的Bochner-Martinelli积分表示及其拓广形式(除了Bochner-Ono公式外)都可以视为文中积分表示的特款。

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ及其CBD的噬菌体表面展示系统的构建

为研究纤维素酶的酶活性和吸附特性之间的关系,将瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ(endoglucanaseⅠ,EGⅠ)和其吸附结构域(cellulose-binding domains,CBD)的基因经PCR扩增后,连接到载体pCANTAB5E上,构建成噬菌粒展示载体pCANTAB5E-egⅠ和pCANTAB5E-egⅠ-cbd。将这些噬菌体展示载体转化到大肠杆菌TGⅠ中,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下得到重组噬菌体。用ELISA和Somogyi方法分别测定了EGⅠ及其CBD的表面展示噬菌体对纤维素的亲和性和EGⅠ的CMC活性,结果显示EGⅠ及其CBD已功能展示于噬菌体表面。该系统的成功构建为今后利用噬菌体展示的方法进行纤维素酶的酶分子改造提供了基础。

两个二亚胺及双膦配体混配铜(Ⅰ)配合物的合成、结构与太赫兹光谱

在甲醇和二氯甲烷混合溶液中制备了2个二亚胺、双膦配体混配的铜(Ⅰ)配合物[Cu2(Dpq)2(dppBz)2](SCN)2·0.5Dpq·3CH3OH (1)和[Cu2(Dppz)2(dppb)2](BF4)2·2CH3OH·2H2O (2)(Dppz=二吡啶[3,2-a:2’,3’-c]并吩嗪,Dpq=吡嗪并[2,3-f][1,10]菲咯啉,dppBz=1,2-双(二苯基磷基)苯,dppb=1,4-双(二苯膦基)丁烷),通过X射线单晶衍射确定了配合物的精确结构,并使用元素分析、核磁共振氢谱、红外光谱、紫外可见吸收光谱、荧光光谱、太赫兹时域光谱(THz-TDS)对配合物进行了表征。1的晶胞中包含2个独立的金属中心,还含有0.5个未配位的Dpq分子,类似结构较为少见;而2为通过双膦配体桥联形成新颖的双核结构。通过弱相互作用力分析可知1为三维立体堆积结构,结构中含有独特的C-S…π作用;2通过C-H…π及π…π作用形成一维无限链,大量弱相互作用的存在使配合物更加稳定。发射光谱表明配合物1在578 nm处有较强的发射,而2在547 nm有绿光发射。配合物2的THz-TDS图中在1.2 THz处的尖锐峰是由C-H···F弱相互作用引起的。

两个二亚胺-铜(Ⅰ)-膦配合物的合成、结构和太赫兹时域光谱（英文）

本文报道了2个新的Cu(Ⅰ)配合物:[Cu(PPh3)2(dppz)]I(1)(PPh3=三苯基膦,dppz=二吡啶并[3,2-a∶2′,3′-c]吩嗪)和[Cu2(dppm)2(dppz)2]Cl2(2)(dppm=双(二苯基膦)甲烷)的合成,并通过X射线单晶衍射、元素分析、核磁共振氢(膦)谱、荧光光谱和太赫兹时域光谱对其进行了分析和表征。分析结果显示配合物1是一个单核配合物,中心Cu(Ⅰ)离子与2个含膦配体(PPh3)和1个含氮配体(dppz)进行配位,形成了一个扭曲的四面体结构。与1不同的是,配合物2是由CuCl,dppm和dppz以1∶1∶1的比例混配得到的双核配合物。其中,双膦配体dppm作为桥联配体,连接了2个Cu(Ⅰ)离子。荧光光谱表明所有的发射峰均源于金属到配体的电荷转移跃迁(MLCT)。同时,使用太赫兹时域光谱技术表征了2种配合物以及相应的配体。

C^n 空间中有界域上第Ⅰ型 Cauchy-Fantappie' 公式的另一种形式

得到的Ｃｎ空间中有界域上全纯函数积分表示，其积分核含有全纯函数导数，是第Ⅰ型Ｃａｕｃｈｙ—Ｆａｎｔａｐｐｉｅ′公式的另一种形式。利用这个公式，通过适当选择其中向量函数，可以得到许多域上全纯函数的第Ⅰ型积分的拓广形式。

北京鸭apoA－Ⅰ溴化氰裂解片段的分离纯化、性质及其与鸭肝HDL受体结合研究

本文对北京鸭ａｐｏＡ－Ⅰ溴化氰裂解片段的理化性质、部分结构和抗原性以及其与鸭肝细胞膜ＨＤＬ受体的结合进行了研究。ａｐｏＡ－Ⅰ用溴化氰裂解后经ＨＰＬＣ分离得两个纯的肽段Ｐ５和Ｐ６，对二肽段作了氨基酸组成分析，并分别测定了Ｐ５，Ｐ６Ｎ端的１４和９个氨基酸残基序列。通过与鸡ａｐｏＡ－Ⅰ的比较，根据同源性及肽段大小，定出Ｐ５、Ｐ６分别位于鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的第１３８－１７０ａａ和第７５－１３６ａａ的区域。Ｉｍｍｕｎｏ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ法测定结果表明，Ｐ５、Ｐ６都含有鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的抗原决定簇；用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫检测，发现鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的Ｐ５、Ｐ６二片段都能与鸭肝细胞膜ＨＤＬ受体结合，提示鸭ａｐｏＡ－Ⅰ的中间区域即第７５－１７０ａａ区域可能参予鸭ａｐｏＡ－Ⅰ与鸭肝ＨＤＬ受体的结合。

鸭RIG-Ⅰ蛋白C端helicase结构域和RD结构域的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用PCR技术将鸭维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)helicase区和RD区部分编码序列分别进行扩增,并分别命名为c、d段;克隆到p ET30a原核表达载体,构建了重组原核表达质粒p ET30a-c和p ET30a-d,通过转化BL21(DE3)感受态菌、IPTG诱导、镍柱纯化表达蛋白,将纯化的c、d蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体(m Ab),采用ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验对单克隆抗体进行鉴定分析。获得鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体有14株与原核分段表达的c、d蛋白有良好的反应性,其中3株与真核表达的RIG-Ⅰ蛋白有良好的反应性。制备的鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体为RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫信号转导途径的研究奠定了基础。

CR3的Ⅰ结构域的克隆和在CHO细胞中的表达及配体结合特性的研究

目的研究白细胞整合素ＣＲ３α亚基的Ⅰ结构域在配体结合中的作用。方法克隆ＣＤ１１ｂ的Ⅰ结构域，用重叠ＰＣＲ的方法将其与信号肽ＤＮＡ连接，克隆到表达载体ＰＥＥ６ＨＣＭＶ．ＧＳ，转化ＣＨＯ－Ｋ１细胞。表达的Ⅰ－结构域经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ｍｏｎｏ－Ｓ柱纯化后，与Ｃ３ｂｉ进行配体结合实验。结果用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得重组的Ⅰ结构域分子量为２９ｋＤ。重组的Ⅰ结构域可以与Ｃ３ｂｉ结合，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析示结合常数为３００±１１３ｎｍｏｌ／Ｌ，这种结合可以被抗Ⅰ－结构域单克隆抗体ＬＰＭ１９Ｃ和ＥＤＴＡ抑制。结论Ⅰ结构域对于结合单体Ｃ３ｂｉ是必要的和充分的，结合需要二价阳离子。

中性粒细胞胞外诱捕网通过CCDC25促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究

目的探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制。方法纳入骨肉瘤患者和健康受试者各20例,通过ELISA检测血清中PAD4和H3cit水平。提取两组人群外周血中性粒细胞,比较NETs形成差异。将NETs与骨肉瘤细胞MG63共孵育,期间加入DNA降解酶DNaseⅠ,分为对照组、NETs组和NETs+DNaseⅠ组。通过蛋白质印迹检测CCDC25蛋白表达水平,CCK8检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平。将si-NC和si-CCDC25转染至MG63,加入NETs共孵育,分为si-NC组和si-CCDC25组,通过蛋白质印迹检测CCDC25蛋白表达水平,CCK8检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平。结果与健康受试者比较,骨肉瘤患者血清中PAD4和H3cit水平升高(P<0.05),NETs形成能力增强。与对照组比较,NETs组CCDC25蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P<0.05)。与NETs组比较,NETs+DNaseⅠ组CCDC25蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CCDC25组CCDC25蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05)。结论NETs通过释放的DNA激活骨肉瘤细胞CCDC25表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和Ⅱ在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了实现鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和II在大肠杆菌中的表达。利用PCR方法扩增得到目的片段,并引入FLAG标签序列(DYKDDDDK),构建重组表达质粒pET28a-E-I/II。转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达目的蛋白质,并对其进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果显示,PCR扩增得到约900 bp的目的片段,经鉴定成功构建重组表达载体pET28a-E-I/II。重组菌在IPTG诱导4 h后在37 000处出现目的蛋白质并且表达量达到高峰。经超声波破碎后SDS-PAGE分析显示,融合蛋白质以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白质与FLAG单抗和E蛋白质阳性血清均可发生特异性反应。表明鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域Ⅰ和Ⅱ在大肠杆菌中成功表达,经鉴定重组蛋白质具有良好的免疫反应性。

PKSI-AT结构域及在组合生物合成研究中的应用

Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)的模块型分子结构组织方式非常适合于组合生物合成研究.结构域和模块通过二级组织方式构成了PKSI的催化单元,其它结构多肽则作为"支架".在"支架"上对结构域和模块两个水平进行突变、替换、插入、缺失等基因操作形成重组PKS,可以理性设计并获得复杂多样的新活性或高活性的聚酮化合物.利用PKSI进行组合生物合成以期获得新聚酮化合物的研究迄今已有约25年,但是目前仍不能够对PKS进行完美的理性设计,快速合成目标活性的新聚酮化合物.PKS中的酰基转移酶结构域的研究在PKS的组合生物合成研究中一直发挥着重要作用.本文结合本课题组的研究基础,对AT结构域的结构、功能及在组合生物合成研究中的最新研究成果作以分析总结.

I-析取ω-语言的几个性质

主要证明了在Xω中不存在极大和极小I-析取ω-语言,提出I-析取辖区概念并证明其是稠密语言.

吡唑类转化生长因子-β受体激酶抑制剂的定量构效关系研究

用分子力学、分子模拟退火动力学、量子化学等方法对转化生长因子-β受体激酶(TβR-Ⅰ)的取代吡唑类抑制剂进行了结构优化.用遗传算法(GFA)并结合多元线性回归方法(MLR),对该类抑制剂进行了定量构效关系研究,筛选出了影响抑制剂活性的主要因素,建立了定量构效关系方程(QSAR).结果表明,分子的总偶极矩的Y分量的平方(μy)2、分子中喹啉环上的氮原子的净电荷QN3、Jurs的相对负电荷表面积RNCS描述等是影响该类化合物抑制活性的主要因素.所得模型对该类化合物关于TβR-Ⅰ的抑制活性有较好的预测效果(R2=0.834,Rcv2=0.575,s=0.243,F=13.439).

人工锌指核酸酶的电子设计与结构模拟

以电子设计用于猪的多位点基因打靶的人工锌指核酸酶为例,探索如何电子设计优化理想的人工锌指核酸酶,以减少人工锌指核酸酶的毒性。采用OPEN电子设计方法,生物信息学方法的预测分析ZFP的立体结构,设计优化合适的连接体和间隔体组合,并通过突变优化Fok I异源二聚体。采用OPEN法设计三指ZF序列,并连接为ZFP序列,设计出长度为6 bp且富含AT碱基的spacer,加上长度为4个氨基酸残基的inter-domain linker,连接FokⅠ切割结构域双突变子异源二聚体,并通过各种软件工具对ZFN的空间结构进行模拟预测,所设计得到的ZFN的有效率超过50%。探索获得电子设计理想ZFN的方案,即特异性结合DNA的锌指蛋白、最佳的linker和spacer的长度与组合以及优化的特异性切割的Fok I异源二聚体切割结构域。

重组人β2糖蛋白1第一结构域二聚体作为抗磷脂抗体综合征B细胞耐受原的初步探讨

目的:探讨重组人β2糖蛋白1第一结构域二聚体(rhβ2-GP1-DⅠ2)对重组人β2糖蛋白1(rhβ2-GP1)免疫小鼠β2-GP1特异性B细胞反应的抑制作用。方法:应用固相ELISA方法,检测静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后免疫小鼠产生的抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2-GP1)滴度及anti-β2-GP1产生水平比率;应用ELISPOT方法,检测静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后免疫小鼠脾脏β2-GP1特异性抗体形成细胞(AFC)数量。结果:静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后,与对照组比较,rhβ2-GP1免疫小鼠βanti-β2-GP1滴度明显降低(P<0.01),anti-β2-GP1产生水平比率下降,β2-GP1特异性AFC数量明显减少(P<0.01)。结论:静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2能够抑制rhβ2-GP1免疫小鼠β2-GP1特异性B细胞的反应能力。

芳基/杂环芳基取代的吡唑类化合物的QSAR研究

用分子力学、分子模拟退火动力学、量子化学等方法对转化生长因子-β受体激酶(TβR-Ⅰ)的取代吡唑类抑制剂进行了结构优化.用遗传算法(GFA)并结合多元线性回归技术(MLR),对该类抑制剂进行了定量构效关系研究,筛选出了影响抑制剂活性的主要因素,建立了定量构效关系方程(QSAR).结果表明,抑制剂分子的最高占据轨道能量EHOMOJ、urs的面积加权部分负电荷表面积WNSA1等是影响AHSPs抑制活性的主要分子参数.所得模型对该类化合物关于TβR-Ⅰ的抑制活性有良好的评估和预测效果(R=0.977,R2cv=0.864,s=0.178,F=51.93).

芳基／杂环芳基取代的吡唑类化合物的定量构效关系研究

用分子力学、模拟退火分子动力学、量子化学等方法对转化生长因子-β受体激酶（TβR-Ⅰ）的取代吡唑类抑制剂进行了结构优化．用遗传算法（GFA）并结合多元线性回归技术（MLR），对该类抑制剂进行定量构效关系研究，筛选出了影响抑制活性的主要因素，建立定量构效关系方程（QSAR）．结果表明，分子的总偶极矩的Y分量μy、分子的最低空轨道（LUMO）与最高占据轨道（HOMO）的能量差△E、Jurs的分子中原子正电荷加权表面积分率FPSA3等是影响该类化合物抑制活性的主要因素．所得模型对该类化合物关于TβR-Ⅰ的抑制活性有较好的预测效果（R=0．898，RCV^2=0．642，s=0．263，F=11．105）．

大鼠SR-BI胞外域与ApoA-I蛋白相互作用的确认

先以含全长SR-BIcDNA序列的重组质粒pMD18-T-rS为摸板进行PCR反应扩增SR-BI得到胞外域cDNA片段,经测序证明正确后,定向克隆到酵母双杂交表达载体,然后与pGBKT7-ApoA-I质粒共转化酵母细胞,通过报告基因及酵母交配试验确认了SR-BI的胞外域部分和ApoA-I之间的确存,观察到ApoA-I与SR-BI胞外域间的相互作用力比与全长的SR-BI间的相互作用力提高了10%。