鸭MHCⅡβ基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

据NCBI上已发表的序列设计引物,通过RT-PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T载体上,经酶切分析及测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌BL21中诱导表达。蛋白纯化后,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,经1∶100倍稀释后用于Western blot分析。结果表明:克隆得到了鸭MHCⅡβ链基因,大小为798 bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为92%;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度达95%。制备的鼠抗鸭MHCⅡβ多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验(ELISA)与免疫印迹法(Western blot)证实抗体的效价高、特异性强,为深入研究鸭MHCⅡ奠定了基础。

溯河洄游型刀鲚MHCⅡβ基因克隆的初步研究

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物中高度多态的基因家族,其编码的蛋白质是适应性免疫的重要组件,其中MHCⅡβ基因表达的蛋白主要参与外源性抗体的呈递,与生物抗性及生态适应性具有重要关系。使用RACE技术首次克隆了溯河洄游型刀鲚(Coilia nasus)MHCⅡβ基因,全长为917 bp,开放阅读框的长度为765 bp,共编码254个氨基酸。通过同源性分析和分子系统进化分析发现,刀鲚MHCⅡβ氨基酸序列与其他硬骨鱼类和哺乳类的相似性在32.09%~71.79%,和鲱形目的鱼类同源性最高(71.79%)。研究结果可为溯河洄游型刀鲚MHCⅡ基因相关的多态性及生态适应等机制的研究提供理论基础。

金钱鱼MHC Ⅱ β基因结构、多态性与组织表达分析

为探究金钱鱼（Scatophagusargus）MHCⅡβ基因的结构和特性，采用同源克隆和RACE等技术，在获得cDNA全序列的基础上，分析其内含子序列、基因多态性和组织表达情况。结果表明，金钱鱼MHCⅡβ基因cDNA序列全长1172bp，其中5＇UTR长34bp，3＇UTR长388bp，开放阅读框（ORF）长750bp，编码249个氨基酸，包含信号肽、B1结构域、p2结构域、连接肽（CP）、跨膜区（TM）和胞质区（cYT）；MHCⅡβ基因由6个外显子和5个内含子组成，其中内含子3将p2结构域分开。从43尾金钱鱼的209个有效克隆中，获得209条不同的核苷酸序列，可归为48个等位基因主型，分别命名为Scar-DXB＊0101～Scar-DXB＊4801，揭示金钱鱼MHCⅡβ基因的多态性很丰富。RT-PCR检测发现，金钱鱼MHCIIB基因在所检测的11种组织中均有表达，其中在脾、鳃、肠和皮肤中表达量较高，在肾、胃、心脏表达量中等，而在眼、脑、肝、肌肉中表达量较低。对健康金钱鱼人工感染嗜水气单胞菌后，发现其MHCIID基因在肝、脾、鳃、肾等组织中的表达量均发生了不同程度的变化，证明该基因在金钱鱼免疫反应中有重要作用。在NJ法构建的系统树中，金钱鱼与舌齿鲈、大西洋鲑等硬骨鱼类的亲缘关系相对较近，而与铰口鲨、原鸡、小鼠、人等的亲缘关系则依次渐远。

西伯利亚鲟MHCⅡβ克隆、原核表达和多克隆抗体制备

旨在构建西伯利亚鲟(Acipenser baerii)MHCⅡβ基因原核表达载体高效表达,并进行多克隆抗体的制备。根据GenBank西伯利亚鲟MHCⅡβ基因序列设计引物,并加上6-His标签和酶切位点,从西伯利亚鲟脾脏细胞中克隆可读编码框(不含信号肽)部分,克隆并测序鉴定后构建Pet30α-MHCⅡβ质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导表达,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western Blot)鉴定,诱导表达的融合蛋白大小约为32 ku,能够与His抗体结合,融合蛋白主要以包涵体形式存在,在温度37℃时1 mmol/L的IPTG诱导4 h可以达到最佳表达量。将表达蛋白通过镍柱层析纯化后,制备兔多克隆抗体,抗体效价达到243 W,为深入研究西伯利亚鲟MHCⅡβ基因免疫学功能提供参考。