牛源产Ⅱ型不耐热肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及重组毒素制备

产Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)大肠杆菌是一类能引起严重腹泻的人畜共患肠道致病菌。为了解LT-Ⅱ在牛源腹泻性大肠杆菌中的流行情况,本研究对2010-2012年间分离的138株大肠杆菌进行了LT-Ⅱ毒素基因的检测,对分离到的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌进行了测序及分析。进一步将LT-Ⅱcl毒素基因双顺反子的ORF克隆入pET30a表达载体、转化Rossatta感受态并诱导表达重组LT-Ⅱcl毒素,经Y-1小鼠肾上腺皮质细胞对重组毒素进行了初步的毒性验证。结果显示,所分离的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌中,有8株表达LT-Ⅱcl毒素,1株表达LT-Ⅱc4毒素,1株表达LT-Ⅱc6毒素。SDS-PAGE和Western Blot结果表明成功地制备出LT-Ⅱcl重组毒素,该重组毒素可以使Y-1小鼠肾上腺皮质细胞发生明显的病变,其细胞最小致死量为17.8 pg。本研究为中国国内首次分离到牛源产LT-Ⅱ型不耐热肠毒素大肠杆菌,为深入研究LT-Ⅱ毒素奠定了基础。

辽宁地区腹泻患者大肠杆菌分离株Ⅱ型不耐热肠毒素的检测及测序分析

目的对辽宁地区人源性腹泻样本中致病性大肠杆菌(Pathogenic Escherichia coli)的毒力因子进行检测,掌握产Ⅱ型不耐热肠毒素(Type Ⅱ heat labile enterotoxin,LT-Ⅱ)大肠杆菌在我国北方地区的流行现状并阐明LT-Ⅱ与其他致病因子间的关系。方法于2014年3月至2015年3月收集辽宁地区人源性腹泻粪便样品,用麦康凯培养基和生化试验的方法分离出大肠杆菌,并用多重PCR方法对毒力基因(elt-Ⅱ、elt-I、sta、stb、K88、K99等)进行检测,对分离到的LT-Ⅱ阳性大肠杆菌中elt-Ⅱ基因进行测序及分型。结果 354份腹泻样品中共分离到携带有毒力因子的大肠杆菌139株,检出率为39.2%。毒力因子阳性大肠杆菌中,有12株携带elt-Ⅱ(8.6%)基因。在12株携带elt-Ⅱ的大肠杆菌中,2株单独携带elt-Ⅱ,6株携带F1,1株携带K88,1株携带astA,2株携带irp2/astA;测序结果表明12株elt-Ⅱ阳性大肠杆菌中有10株携带elt-Ⅱc1亚型,2株携带elt-Ⅱc4亚型。结论在引起人源性腹泻的毒力因子中有大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒的存在,且主要以LT-Ⅱc1为主要流行型。

大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素快速检测方法的建立与应用

为了建立新型、快速的大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)的检测方法,试验采用LT-Ⅱ家族的保守序列设计交叉引物等温扩增技术(cross priming amplification,CPA)和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,分别对这两种方法的反应温度、Bst聚合酶浓度和扩增时间进行优化,进一步对反应的特异性和敏感性进行研究,最后用这两种方法检测156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本,并以实时荧光定量PCR方法作为参照进行对比。结果表明:建立的LAMP和CPA方法对LT-Ⅱ基因具有很好的特异性,LAMP和CPA方法的最低检出限分别为6. 7×102cfu/m L和6. 7×101cfu/m L,CPA法具有更高的敏感性。对156份犊牛大肠杆菌临床腹泻样本的检出率为7. 7%(12/156),CPA、LAMP和实时荧光定量PCR三种检测方法的一致性为100%。说明建立的CPA方法不仅具有较高的特异性和敏感性,且不需要昂贵的仪器即能在短时间内完成靶基因的检测。