基于常规引物靶向结核分枝杆菌Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位的恒温扩增

目的探讨基于特异常规引物(即引物不需折叠成特定二级结构)靶向恒温扩增重复DNA序列的方法,并测试其检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的可能性。方法以合成的重复DNA或以抽提的细菌基因组DNA为模板,用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶进行恒温扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果合成的重复DNA可用其特异常规引物进行恒温扩增。进一步,Mtb H37Rv Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRUs)可用其特异常规引物对(即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R)或单引物(即Ⅱ_MIRU-F)进行恒温扩增。相比于非分枝杆菌菌株、非结核分枝杆菌菌株、Mtb复合物菌株和临床分离株,Ⅱ_MIRU-F能够高特异地扩增Mtb菌株。Ⅱ_MIRU-F针对Mtb H37Rv基因组DNA的检测下限较高,且不能特异地区分Mtb阴性痰液样本和Mtb阳性痰液样本。结论常规引物可恒温扩增重复DNA序列(包括MtbⅡ型MIRUs);MtbⅡ型MIRUs特异引物Ⅱ_MIRU-F不适合用于痰液样本的检测。

分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究

目的评价分枝杆菌散在重复单位(MIRU)分型方法在结核病流行病学上的应用,探讨该方法的应用前景。方法采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型,这些菌株均已进行IS6110-RFLP分型。结果MIRU分型结果产生只需1d。158株结核分枝杆菌共产生105个类型,其中65个为独特类型。在MIRU的12个区中,重复区4、10、26、40具有较高的多态性。用Hunter-Gaston Index(HGI)对2种方法进行评价,IS6110-RFLP的分辨指数为99.4%,MIRU技术的分辨指数为97.8%。当IS6110拷贝数小于等于10个时,IS6110-RFLP的分辨指数为98%,MI-RU的分辨指数达到98.2%。结论MIRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点,便于普及,可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用。

分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究

目的评价分枝杆菌散在重复单位（MIRU）分型方法在结核病流行病学上的应用，探讨该方法的应用前景。方法采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型，这些菌株均已进行IS6110－RFLP分型。结果MIRU分型结果产生只需1d。158株结核分枝杆菌共产生105个类型，其中65个为独特类型。在MIRU的12个区中，重复区4、10、26、40具有较高的多态性。用Hunter-Gaston Index（HGI）对2种方法进行评价，IS6110－RFLP的分辨指数为99．4％，MIRU技术的分辨指数为97．8％。当IS6110拷贝数小于等于10个时，IS6110－RFLP的分辨指数为98％，MIRU的分辨指数达到98．2％。结论MtRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点，便于普及，可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用。

吉林省鹿源牛分枝杆菌MIRU分型研究

为了解鹿源牛分枝杆菌(M.bovis)基因多态性,初步建立适合吉林省鹿源M.bovis的基因分型方法,本研究利用12个分枝杆菌散在重复单位(MIRU)位点,对96株鹿源M.bovis吉林分离株进行MIRU基因分型研究。结果显示,12个位点中有8个位点(MIRU2、4、16、23、27、31、39及40)具有多态性,可以将96株菌株分为11个基因型,分辨力指数(H)为0.893,其中6个中度多态性位点的分辨力为0.877。其余4个位点(MIRU10、20、24及26)未显示多态性。研究结果表明,鹿源M.bovis与其他宿主来源的M.bovis在基因分型上存在差异。MIRU位点对鹿源M.bovis具有良好的分辨力,该分型方法可以作为鹿结核病分子流行病学研究的有效方法。

结核分枝杆菌Mtub-39位点多态性与下游基因表达关系的研究

目的分析结核分枝杆菌(MTB)北京型菌株及非北京型菌株5个有明显差异的MTB散在分布重复单位(MIRU)位点,研究其多态性与下游基因表达的关系。方法利用生物信息学方法预测5个MIRU位点(ETR-C、Mtub-30、Mtub-39、MIRU-27、MIRU-40)下游相邻基因启动子区域。通过PCR方法扩增该区域并与分枝杆菌启动子探针载体pMC210连接,重组质粒测序正确后,用电穿孔方法转化耻垢分枝杆菌mc2155。采用Real-Time PCR技术检测报告基因lacZ的转录水平,验证MIRU位点多态性对其下游基因表达的影响。结果 Mtub-39位点核心区域内含有其下游基因的启动子。成功构建了分别带有1、3、5个拷贝重复序列的Mtub-39位点的重组质粒。Real-Time PCR结果显示,有多态性的Mtub-39位点(pMC210-Mtub-39-N158、pMC210-Mtub-39-N139及pMC210-Mtub-39-N146)对报告基因lacZ的转录调控差异有统计学意义(P=0.006 5)。结论 Mtub-39位点的多态性能明显影响下游基因启动子的活性进而调节其表达。

分枝杆菌散在分布重复单位分型法在分辨北京株结核分枝杆菌基因分型中的初步研究

随机按比例抽取武汉市结核病防治所2005年7—12月肺结核病患者的菌株，为评估分枝杆菌散在分布重复单位（MIRU）方法对北京家族株的分辨能力进行分型分析。

某高级中学一起结核病聚集性疫情传播的时空序列与分子流行病学分析

目的探讨本起学校结核病聚集性疫情传播的原因、特点和规律,为持续改进学校结核病控制策略的有效实施提供科学依据。方法遵照广东省汕头市卫生健康局对本起疫情处置工作的具体要求,以指示病例为中心、以学习生活空间要素为重点、以人际交往活动要素为辅助进行密切接触者筛查,对纳入者进行结核病可疑症状检查、X线胸部检查和结核菌素(PPD)皮肤试验;对其中任何1项异常者进行IFN-γ释放试验、CT影像检查、痰涂片抗酸染色检查、分枝杆菌培养与菌种鉴定和Xpert MTB/RIF分子检测,以综合诊断结核病例;对分离培养获得的结核分枝杆菌,分析其ETRA、ETRB、ETRC、ETRE、ETRF、MIRU10、MIRU20、MIRU26、MIRU39、MIRU40、Mtub04、Mtub21、Mtub38、Oub11b、Qub26等15个基因位点的串联重复拷贝数,分析其成簇性以判断病例间的传播关系。结果(1)指示病例首次结核可疑症状出现并一直在校学习5个月后,出现双肺上叶斑片状、斑点状、条索状密度增高影和左肺上叶多发空洞(最大者约2.1 cm×1.7 cm)等病变,培养与分子检测阳性;(2)指示病例发现的3个月内,在该校相继发现其他15例学生肺结核患者,其中3例有临床症状、3例痰涂片镜检可疑阳性、9例培养阳性、7例分子检测阳性,10例与指示病例有同班上课、同舍住宿和同室晚自习等空间性密切接触,4例与指示病例有直接或间接的人际密切交往,1例则未找到明确的密切交往线索;(3)对9例患者分离培养的结核分枝杆菌进行基因分型,8例得到成功结果,15个VNTR-MIRU分型位点的拷贝数模式完全相同;(4)依据PPD皮肤试验≥5 mm判断结核感染,409例受检者中252例阳性,潜伏感染率为61.61%,潜伏感染率在指示病例班级与后续发现病例班级学生间差异有统计学意义(100%vs.56.58%,χ^(2)=30.781,P<0.001),而在男-女、学生-教职工、寄宿生-走读生、不同楼层学生、同层同侧-同层对侧学生等多组人群间则差异无统计学意义(P>0.05)。结论该起结核聚集性疫情为同一传染源传播所致,且导致了远高于一般人群的结核潜伏感染率,学校结核病控制管理缺失为其主要原因,强化学校结核病控制措施的有效执行力刻不容缓。

2005—2006年奥地利难民中一次耐多药结核病的爆发

背景:2005—2006年奥地利结核病参比室验室确诊了4例菌株基因型相同的耐多药结核病患者。目的:明确耐多药结核菌传播途径。方法:通过查阅结核报告记录和医院出院单进行流行病学病例研究。结果:2004年6月,这个耐多药菌群中的原发病例(38岁),在因非法移民被扣留7个月后,最初被诊断为非耐多药结核病。到2005年3月,他有4个月失访。2005年6月他被诊断为肺和喉部的耐多药结核。出院后,这个病例又出现了失访,直到2006年4月,他因复发耐多药结核再次入院。2006年4月3例和原发病例有相同菌型的耐多药肺结核病例被确诊:原发病例5岁的女儿和25岁的朋友及朋友6个月的儿子。结论:由于奥地利耐多药结核病(MDR-TB)源于HIV阴性群体,显然有必要实施国家指南进行MDR-TB的管理。

黔北地区城、乡肺结核发病及分子流行病学特征差异比较

目的比较黔北地区城乡肺结核患者流行病学特征及结核分枝杆菌基因型特征的差异,分析农村结核高发的原因。方法对2011年12月-2013年6月期间黔北地区某医院及某疾病预防控制中心就诊肺结核患者的人口学资料及结核相关的行为生活方式特征进行调查,收集痰液标本并进行培养,培养阳性的进一步采用分枝杆菌散在重复单元(MI-RU)技术对结核分枝杆菌进行基因分型。结果农村患者初中以下文化程度、家庭年均人收入少于4 000元及肉类摄食每天不足一次者的构成比分别为56%、67. 18%、54. 96%,高于城市(镇)的26. 15%、50. 77%、40%(均P<0. 05);农村患者的结核分枝杆菌基因成簇率为19. 08%(25/131),高于城市(镇)的7. 69%(5/65)(P<0. 05),农村组基因簇群中具有流行病学关联的占48%,高于城镇组的0%。结论黔北地区贫穷及高近期传播仍然可能是农村肺结核高发的原因。