Ⅱ型单胺囊泡转移体在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的构建稳定表达Ⅱ型单胺囊泡转移体(VMAT2)的SH-SY5Y细胞系。方法构建VMAT2真核表达载体,利用脂质体转染神经母细胞瘤SH-SY5Y,选择筛选后挑取单克隆扩大培养,通过Western-blot及免疫荧光的方法鉴定蛋白质在细胞中的表达,并通过免疫双荧光技术对VMAT2在细胞系中的分布进行定位。结果Western-blot及免疫荧光结果显示该蛋白在挑选的细胞系中有高效表达。免疫双荧光结果显示表达的蛋白定位在大密度核心囊泡(LDCV)。结论该细胞系的成功构建为研究VMAT2在帕金森氏病(PD)发病机制中的作用奠定良好的基础。

A53Tα—synuclein与Ⅱ型单胺囊泡转移体相互作用的鉴定

目的鉴定A53Tα—synuclein（A53T—SYN）与Ⅱ型囊泡单胺转移体（VMAT2）在体外分子间的相互作用，为研究α-synuelein在帕金森病（PD）发病机制中的作用提供依据。方法大肠杆菌B121中表达带GST标签的A53T-SYN蛋白，考马斯亮蓝染色和Western印迹检测蛋白质的表达，以该蛋白为诱饵，通过GST-Pull Down鉴定A53T-SYN与人脑提取物中的VMAT2在体外分子间的作用。结果考马斯亮蓝染色和Western印迹检测到GST-A53T-SYN在大肠杆菌中的高效表达，GST-Pull Down实验后的Western印迹检测发现与A53T—SYN作用的VMAT2蛋白。结论A53T-SYN与VMAT2在体外存在着分子间的相互作用。

β-synuclein对Ⅱ型囊泡单胺转移体表达的促进作用

目的探讨β-突触核蛋白(β-synuclein)对Ⅱ型囊泡单胺转移体(VMAT2)表达的影响。方法通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色检测β-synuclein稳定表达对细胞内ROS水平的影响;采用免疫荧光双标法、免疫组织化学法及Western blotting检测VMAT2在稳定转染β-synuclein的SH-SY5Y细胞及正常SH-SY5Y细胞中的表达情况。结果 DCFH-DA荧光染色显示,稳定表达β-synuclein的细胞的荧光强度较正常SH-SY5Y细胞明显减弱。VMAT2在稳定转染β-synuclein的SH-SY5Y细胞中的表达水平较正常SH-SY5Y细胞明显升高。结论β-synuclein能够促进VMAT2的表达,减少胞浆内DA含量,抑制ROS产生,在帕金森病多巴胺神经元变性过程中对其起到保护作用。

健脾止动汤通过纹状体内多巴胺系统治疗多发性抽动症大鼠的机制研究

目的观察健脾止动汤通过纹状体内多巴胺(DA)囊泡循环对多发性抽动症(TS)模型大鼠的影响。方法将42只大鼠按照完全随机分组法分为空白组10只、造模组32只。造模组给予腹腔注射亚氨基二丙腈(IDPN)制备模型,空白组给予腹腔注射等体积生理盐水,均1次/d,连续7 d。将造模成功的30只大鼠按照完全随机分组法分为模型组、健脾止动汤组(中药组)、泰必利组,每组10只。中药组给予健脾止动汤免煎颗粒1.6 g/100 g灌胃,泰必利组给予泰必利混悬液2.1 mg/100 g灌胃,空白组、模型组均给予1 mL/100 g生理盐水灌胃,1次/d,连续4周。对比各组第1、8、15、22、29、36天刻板运动评分,纹状体内酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)、Ⅱ型囊泡单胺转移体(VMAT2)、α突触核蛋白(α-syn)表达。结果第8天造模结束时,与空白组比较,模型组、泰必利组刻板行为评分高(P<0.05);第22天起,与模型组比较,中药组、泰必利组刻板行为评分低(P<0.05),中药组与泰必利组各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与第1天比较,第8天与第15天模型组、中药组、泰必利组刻板行为评分均升高(P<0.05);与第8天比较,第29天起中药组、泰必利组刻板行为评分均降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组纹状体内TH蛋白表达高、DAT蛋白表达低(P<0.05)。与模型组比较,中药组、泰必利组TH蛋白表达低(P<0.05),中药组DAT蛋白表达高(P<0.05)。与空白组比较,模型组纹状体内α-syn蛋白表达高、VMAT2蛋白表达低(P<0.05)。与模型组比较,中药组、泰必利组α-syn蛋白表达低,VMAT2蛋白表达高(P<0.05)。结论健脾止动汤通过调节TS模型大鼠纹状体内DA的囊泡循环,抑制α-syn过度释放,提高DAT及VMAT2表达,降低大脑突触间隙内的DA含量,发挥抗抽动作用。