不同年龄女性血清可溶性模型基质金属蛋白酶1水平变化及对人成骨细胞凋亡的诱导

背景:前期研究表明膜型基质金属蛋白酶1在骨重建过程中可调节骨形成与骨吸收。目的:探讨女性血清可溶性膜型基质金属蛋白酶1水平年龄变化及膜型基质金属蛋白酶1与骨密度﹑骨转换生化指标的关系。设计、时间及地点:横断面调查,于2006-01/2007-10在中南大学湘雅二医院完成。对象:长沙地区304名20～80岁的女性志愿者,平均年龄(49.6±14.1)岁,体质量指数(23.3±3.4)kg/m2。方法:培养正常成人成骨细胞。留取受试者空腹静脉血,Westernblot、ELISA检测血清膜型基质金属蛋白酶1可溶性蛋白水平,ELISA检测血清Ⅰ型胶原N-末端交联肽﹑骨钙素水平。测量受试者腰椎及左侧股骨颈骨密度。用重组可溶性膜型基质金属蛋白酶1蛋白干预人成骨细胞。主要观察指标:①人成骨细胞基质金属蛋白酶1蛋白表达。②人血清可溶性膜型基质金属蛋白酶1浓度与年龄、骨密度、骨钙素、Ⅰ型胶原N-末端交联肽的关系。③人成骨细胞鉴定。④细胞凋亡检测结果。⑤重组可溶性膜型基质金属蛋白酶1蛋白诱导人成骨细胞凋亡的作用。⑥型胶原N-末端交联肽检测结果。⑧重组可溶性膜型基质金属蛋白酶1蛋白对人成骨细胞黏附功能的影响。结果:Westernblot检测到血清含有丰富的可溶性膜型基质金属蛋白酶1,血清可溶性膜型基质金属蛋白酶1与骨密度﹑Ⅰ型胶原N-末端交联肽﹑骨钙素呈负相关。重组可溶性膜型基质金属蛋白酶1蛋白促进细胞凋亡的作用呈剂量依赖性,且此作用可被乙二胺四乙酸阻断。重组可溶性活性膜型基质金属蛋白酶1蛋白抑制人成骨细胞在Ⅰ型胶原上的黏附。结论:女性血清可溶性活性膜型基质金属蛋白酶1与骨密度﹑Ⅰ型胶原N-末端交联肽﹑骨钙素有明显相关性。重组可溶性活性膜型基质金属蛋白酶1蛋白可通过降解骨基质蛋白,诱导人成骨细胞凋亡。

国产多孔钽对MG63细胞中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4表达的影响

背景:目前有证据已证实国产多孔钽具有良好的生物相容性及促成骨性能,但具体的成骨机制及对成骨因子的影响尚不明确。目的:观察国产多孔钽材料对MG63细胞Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2及钙结合蛋白A4表达的影响。方法:将对数生长期的MG63细胞接种于24孔板,分3组培养:空白组加入常规培养基,钽浸提液组加入多孔钽材料浸提液,钽支架组加入多孔钽材料与常规培养基。培养第1,3,5,7,9天,CCK-8法检测各组细胞增殖;培养第5天,采用ELISA酶联免疫吸附法检测各组细胞分泌Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4的水平,Western-blot法检测各组细胞中钙结合蛋白A4、Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2蛋白的表达。结果与结论:(1)随着培养时间的延长,各组细胞数量呈逐渐增加趋势,3组不同时间点的细胞增殖比较无差异(P> 0.05);(2)钽支架组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2分泌高于空白组、钽浸提液组(P <0.05),钽浸提液组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2分泌高于空白组(P <0.05);钽支架组钙结合蛋白A4分泌低于其他两组(P <0.05);(3)钽支架组中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2蛋白表达均高于空白组、钽浸提液组(P <0.05),钽浸提液组中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2蛋白表达高于空白组(P <0.05);钽支架组钙结合蛋白A4蛋白表达均低于空白组、钽浸提液组(P <0.05);(4)结果表明,国产多孔钽材料可促进MG63细胞分泌Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2,抑制其分泌钙结合蛋白A4。

人膝关节软骨下骨成骨细胞和软骨细胞的共培养

背景:软骨细胞移植等组织工程方法已经成为非常有潜力的骨关节炎治疗措施,软骨下骨的成骨细胞对软骨细胞的作用不仅参与骨关节炎的发生和发展,而且与细胞移植治疗预后有着密切的关系。目的:培养人膝关节软骨下骨成骨细胞和软骨细胞,构建两者共培养的细胞培养模型,探讨软骨下骨成骨细胞对软骨细胞的作用。方法:收集骨关节炎患者行全膝关节置换和严重创伤患者行截肢后遗弃的胫骨平台组织,采用Ⅰ型胶原酶连续消化后进行贴壁培养的方法,培养软骨下骨的成骨细胞,应用Ⅱ型胶原酶消化方法,培养软骨细胞,然后应用多孔插入器细胞培养池构建成骨细胞和软骨细胞三维共培养模型。结果与结论:通过免疫组化,NBT/BCIP染色,茜素红染色等检查,证实成功培养出成骨细胞和软骨细胞。实时定量RT-PCR显示,在与骨关节炎的软骨下骨成骨细胞共培养的软骨细胞中,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达明显下降。可见骨关节炎患者的成骨细胞能促进软骨细胞的退变。

Sema7A干预钛微粒诱导鼠MC3T3-E1成骨细胞的凋亡

背景:Sema7A是一种细胞表面蛋白,它可以促进破骨细胞的融合同时促进成骨细胞的迁移,从而影响骨的动态平衡。推测,Sema7A siR NA可能减弱钛微粒成骨细胞分化。目的:分析信号素7A(Sema7A)对钛颗粒抑制鼠MC3T3-E1前成骨细胞活性过程的影响。方法:取第六七代生长状态良好的小鼠颅骨前成骨细胞(MC3T3-E1),分为4组培养。其中空白对照组为单独培养的细胞;标准对照组加入了钛微粒共培养;实验1组加入Sema7A过表达质粒,实验2组加入Sema7AsiR NA进行干扰。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Q-PCR检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mR NA表达情况;Western-blot检测骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达情况;茜素红钙结节染色检测成骨细胞的矿化程度。结果与结论:结果提示标准对照组、实验1组检测到骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白表达明显减少而实验2组骨涎蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白则比标准对照组表达增加(P<0.05)。流式细胞仪结果提示实验1组成骨细胞凋亡率明显高于其他组(P<0.05),而实验2组则比标准对照组凋亡率降低(P<0.05)。茜素红染色检测结果显示实验1组未见明显的矿化结节,实验2组有矿化结节形成。结果表明通过基因干扰技术抑制Sema7A活性可以对钛颗粒抑制鼠MC3T3-E1成骨细胞分化的过程进行干扰,进而为临床上用生物技术治疗磨损微粒诱导的骨溶解问题提供了一条可行的思路。

高糖、高胰岛素环境成骨细胞Glut4表达对成骨功能的影响

目的观察高糖、高胰岛素环境下原代成骨细胞葡萄糖转运蛋白(Glut)4、骨钙素(BGP)、Ⅰ型胶原蛋白(CoiⅠ)等蛋白表达,研究成骨细胞自身葡萄糖代谢对成骨功能的影响。方法原代小鼠成骨细胞分离提取后体外诱导培养,培养成熟后分为4组,正常对照组(N组)、高胰岛素组(Y组)、高糖组(T组)、高糖高胰岛素组(D组),分别诱导6 h和24 h,用Western印迹检测各组细胞Glut4的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BGP、CoiⅠ的含量,碱性磷酸酶染色观察成骨细胞形态,茜素红染色观察细胞外基质矿化结节情况。结果细胞诱导6 h,与N组相比,Y组、T组、D组细胞Glut4表达明显增加(P<0.05),诱导24 h后Y组Glut4表达明显增加,T组Glut4蛋白表达明显减低(P<0.05),D组与N组相比无明显差异;细胞诱导6 h,与N组相比,T组、D组BGP分泌明显增加(P<0.05),诱导24 h后Y组细胞BGP分泌明显增加,T组细胞BGP分泌明显降低(P<0.05),D组与N组相比无差异;与N组相比,不同诱导时间Y组、T组、D组CoiⅠ分泌无明显差异。结论葡萄糖代谢关键蛋白Glut4表达调节成骨细胞特异功能蛋白BGP分泌,通过改善成骨细胞自身葡萄糖代谢促进基质合成和矿化,成骨细胞葡萄糖代谢关键蛋白Glut4有望成为糖尿病骨质疏松治疗的新靶点。

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景：人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。目的：体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。方法：取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。结果与结论：体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24h内贴壁,培养5-7d后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G0/G1,S和G2/M所占比例分别为（88±2）%,（12±2）%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。

氟对成骨细胞骨钙素和Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的探讨氟对成骨细胞骨钙素基因(OCN)和Ⅰ型胶原蛋白基因(COL1)表达的影响。方法采用人成骨肉瘤细胞系(Saos-2)建立体外染氟模型,即经体外细胞培养后分别以不同浓度梯度氟化钠(0.0 mg/L,5.0 mg/L,10.0 mg/L,20.0 mg/L和40.0 mg/L NaF)处理;在实验组中加入坏死凋亡抑制剂(Necrostatin-1,Nec-1)抑制细胞的程序性坏死,提取细胞的总mRNA,通过实时荧光定量RT-PCR方法,分析染氟对Saos-2细胞骨钙素基因和Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响。结果与对照组相比,经5.0 mg/L,10.0 mg/L,20.0 mg/L和40.0 mg/L NaF处理后,OCN和COL1的表达域上调,其中以(5.0~10.0 mg/L)增强的最明显。低浓度氟化钠(5.0~10.0 mg/L)可以促进OCN和COL1的基因表达,高浓度(>20.0 mg/L)氟化钠对OCN和COL1基因的相对表达量上调程度较低;加入Nec-1的组OCN和COL1基因表达域较对照组上调明显。结论在基因水平上,低浓度氟化钠(5.0~10.0 mg/L)上调人成骨细胞中OCN和COL1基因的表达;高浓度氟化钠(>20.0 mg/L)对OCN、COL1基因的相对表达量的上调程度较低。Nec-1对两基因的表达均为上调。氟诱导的程序性坏死能够影响成骨相关基因OCN和COL1的表达。

Ⅰb～Ⅱa期子宫颈鳞癌淋巴结转移相关因子的检测及风险预测模型的建立和验证

宫颈癌为全球妇女第二大恶性肿瘤，淋巴结转移是其显著的预后影响因素^[1]。早期宫颈癌的浸润转移是一个多步骤、多因素过程，包括癌细胞与细胞外基质的黏附、酶解和运动等，涉及到多种转移相关因子，如细胞黏附分子变异体6（CD44v6）、上皮型钙黏附素（E—cad）、基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP-9、MMP-7、

积雪草酸促进成骨细胞分化的机制

目的研究积雪草酸在体外对成骨细胞分化的影响,并初步探讨其作用机制。方法使用小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)进行成骨分化相关实验,将积雪草酸作为成骨诱导条件下的附加刺激,用CCK8法检测药物对成骨细胞活力的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)染色评价成骨细胞的早期分化能力;采用茜素红染色观察钙结节的形成数量,评估成骨细胞的矿化能力;用实时荧光定量PCR法检测成骨细胞标志物的水平;采用蛋白免疫印迹法检测MAPKAKT信号通路及凋亡相关蛋白的表达。结果1~40μmol·L^-1积雪草酸对细胞无毒性作用;随着积雪草酸刺激浓度的增加,ALP和茜素红的染色强度也随之增加。经积雪草酸刺激3d后,Ⅰ型胶原蛋白基因的表达水平出现明显变化;第7天时,ALP、骨形态发生蛋白2、转录因子、核心结核因子α1和骨钙素的表达水平显著增加。经积雪草酸刺激后,MC3T3-E1细胞内MAK-AKT信号通路激活;同时,抗凋亡蛋白的表达上调,促凋亡蛋白的表达下降。结论积雪草酸以浓度依赖的方式促进成骨细胞分化,抑制成骨细胞凋亡,该效应可能是通过激活MAPK-AKT信号介导。

含硅二氧化钛纳米管层的体外生物活性

背景:钛合金长期以来被用作可植入的生物材料,通过在其表面制备二氧化钛纳米管层可提高材料表面与骨的接触面积,然而将硅元素注入纳米管层表面是否可以进一步提高材料生物活性,有待进一步研究。目的:探讨钛表面含硅二氧化钛纳米管层对成骨细胞MC3T3-E1细胞活性的影响,为医用钛金属生物管层的改良提供实验依据。方法:利用阳极氧化法技术在钛表面制备二氧化钛纳米管层,采用等离子体浸没离子植入和沉积法,将硅离子沉积在二氧化钛纳米管层表面(实验组),以二氧化钛纳米管层为阳性对照组,光滑钛片作为阴性对照组。用扫描电镜观察各组形貌,X射线衍射仪测定各组元素组成。3组管层表面分别种植MC3T3-E1细胞,检测第1,3及5天各组细胞黏附铺展、增殖情况,第7天各组细胞相关基因的表达及第3,4周各组细胞的钙沉积情况。结果与结论:(1)扫描电镜下显示硅元素的加入没有改变管层的表面形貌,且第1天仅实验组细胞上可以观察到有丝状伪足扩展,第3天丝状伪足活性增加并开始合并,第5天丝状网络结构较其他两组明显增多;(2)X射线衍射仪显示实验组出现了对应为硅元素特征峰;(3)MTS法显示培养第1,3天,黏附于实验组及阳性对照组表面的细胞数量比阴性对照组显著增多,第5天,实验组上的细胞增殖显著高于对其他2组(P<0.05);(4)实时定量RT-PCR检测结果显示7 d时实验组中成骨相关基因Ⅰ型胶原蛋白,碱性磷酸酶,Runx2,骨钙素和骨桥蛋白基因表达均高于对照组(P<0.05);(5)第3,4周实验组和阳性对照组上的细胞与阴性对照组相比钙矿物结节形成明显升高,第4周含实验组沉积的钙矿物比其他2组显著增加(P<0.05);(6)结果提示,二氧化钛纳米管层可以通过等离子体浸没离子植入和沉积法加载硅离子并具备良好的成骨活性。

Cad11高和低表达肾癌细胞分选与Cad11对肾癌细胞迁移作用的影响

目的分选Ⅱ型成骨细胞型钙黏附蛋白(cadherin-11,Cad11)高和低表达的肾癌细胞786-O细胞群,并证实Cad11在肾癌细胞786-O中的迁移作用。方法将质粒pBMN-Ⅰ-GFP-Cad11转染于Phoenix细胞进行包装,之后感染786-O细胞,流式细胞仪分选后扩大培养建立786-LG细胞。将786-LG细胞经Cad11抗体2C7孵育后用BSA封闭,洗涤后加入标记APC的二抗,同时以786-LG细胞(未经任何处理)和786-LG细胞(只加入标记APC的二抗处理)作为阴性对照确定分选门,绿色荧光通道和红色荧光通道进行双参数分析,流式细胞仪分选技术筛选Cad11高和低表达的786-O肾癌细胞群,蛋白质印迹法检测分选细胞Cad11的表达。786-Cad11+和786-Cad11-细胞血清饥饿24h后接种于内室(细胞数为1×104),每组设3个复孔,Transwell细胞迁移实验和细胞结晶紫染色计数穿过小室的细胞数目,以穿过膜的细胞数目评估Cad11对其肾癌细胞786-O的迁移作用。结果成功构建786-LG细胞。流式细胞仪检测结果显示,786-LG细胞中Cad11阳性细胞亚群占细胞总数的75.98%。Cad11细胞群分选后,GFP+/APC+双阳性细胞和GFP+/APC-单阳性细胞分别占细胞总数的28.0%和20.1%。蛋白质印迹法检测结果表明,Cad11相对表达量786-LG细胞为0.25±0.02,786-Cad11+细胞为0.60±0.03,786-Cad11-细胞为0.10±0.01,差异有统计学意义,F=132.32,P<0.001。与786-LG细胞相比,两个细胞亚群786-Cad11+和786-Cad11-中Cad11蛋白的表达量均有明显变化,前者蛋白表达量升高至2.41倍(P=0.007),后者蛋白表达量降低至0.41倍(P=0.004),差异均有统计学意义。Transwell迁移实验结果表明,786-LG细胞迁移数目为114.33±4.09,786-Cad11+细胞迁移数目为139.00±5.19,786-Cad11-细胞迁移数目为77.67±3.71,差异有统计学意义,F=49.65,P=0.000 2。结论成功建立了高和低表达Cad11的786-O细胞模型,并证实Cad11的表达与肾癌细胞的迁移密切相关。

同种异基因组织工程骨修复骨缺损IFN-γ和IL-10的表达

[目的]通过检测同种异基因组织工程骨(tissue engineering bone,TEB)修复骨缺损血清IFN-γ、IL-10水平和脾内IFN-γmRNA、IL-10mRNA的表达,探讨同种异基因TEB的免疫原性。[方法]Ficoll-Hypaque梯度密度离心法分离出成年兔骨髓间充质干细胞(MSCs),培养扩增。取第3代细胞,化学法诱导成成骨细胞(ODC)。将ODC按1×109/L密度接种至羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP),共同培养,构建TEB。动物随机分三组(TEB,HA/TCP组,自体骨组),每组24只,人为造成兔左桡骨处1.0 cm左右长创伤性骨缺损,植入TEB、HA/TCP、自体骨。观察伤口愈合情况;于术后第4、10 d、6周,麻醉下取下腔静脉血ELISA法测血清IFN-γ、IL-10水平;取脾行HE染色观察;RT-PCR测IFN-γ、IL-10 mRNA表达。[结果]各组动物IL-10、IL-10 mRNA比IFN-γ和IFN-γ mRNA高,其中TEB组IFN-γ和IFN-γmRNA较其他两组稍高,IL-10和IL-10 mRNA较其他两组稍低,IFN-γ、IL-10水平和IFN-γmRNA、IL-10 mRNA表达同组前后比较有统计学差异(P<0.05),组间比较没有差异(P>0.05)。[结论]由同种异基因MSCs诱导而成的ODC与HA/TCP构建的TEB免疫原性极低,可以用于修复骨缺损。