金银花黄芪合用抗Ⅱ型疱疹病毒药效分析

目的：获得抗 Ｈ Ｓ Ｖ 中药的最佳配方比。方法：以 Ａ Ｃ Ｖ 为阳性对照组，采用空斑减数实验，观察金银花与黄芪单用及合用抗 Ｈ Ｓ Ｖ２３３３ 株的药效，用中效作用原理对药效进行了分析。结果：在 Ｈｅｐ２ 细胞系统中， Ａ Ｃ Ｖ 对 Ｈ Ｓ Ｖ２３３３ 株直接杀灭增殖抑制感染阻断的 Ｅ Ｄ５０分别为１６４５，１０８５， １８６２ μｇ／ｍ ｌ 合用比为 １（ Ｅ Ｄ５０）金银花／１（ Ｅ Ｄ５０）黄芪时，相应数值分别为 ０６７， ０８０，１１９ μｇ／ｍ ｌ，药效比 Ａ Ｃ Ｖ 强，而且合用指数（ Ｃ Ｉ）较小，协同作用十分明显。结论：上述抗 Ｈ Ｓ Ｖ２３３３株合用比是组方时的最佳配方比。

鲤疱疹病毒二型(CyHV-Ⅱ)疫苗研究进展

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-Ⅱ)对任何发育时期的金鱼、鲫鱼及其杂交品种均具有感染能力,能够引起金鱼疱疹病(goldfish haematopoietic necrosis, GFHN),是一种传染性强且死亡率极高的疫病,给我国金鱼和鲫鱼养殖业造成巨大经济损失,鱼用疫苗的研发是预防和治疗该疫病最有效的办法。综述了CyHV-Ⅱ灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗和纳米递送疫苗的研究进展,并对鱼用疫苗纳米材料的应用前景进行了探讨,以期为金鱼疱疹病害防治和鱼用疫苗研究提供新技术方法和新思路策略。

转录因子NF-κB对鲤疱疹病毒Ⅱ型基因启动子的表达调控研究

为深入探究NF-κB信号通路对CyHV-2感染过程的影响,在CyHV-2感染的GiCF细胞中加入NF-κB激动剂,通过RT-qPCR和Western Blot分析在感染24、72、96 h后CyHV-2编码基因在转录和翻译水平的表达情况。结果显示,在加入NF-κB激动剂后的72、96 h,CyHV-2编码基因转录和翻译水平均明显高于对照组,提示NF-κB促进CyHV-2编码基因的转录及翻译。为进一步阐明NF-κB如何影响CyHV-2的转录和翻译,利用生物信息学软件预测CyHV-2部分编码基因的启动子序列中和NF-κB的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验分析NF-κB对启动子活性的影响。结果表明,NF-κB过表达提高了病毒基因启动子活性,提示NF-κB可以通过促进CyHV-2基因的启动子活性来增强病毒复制水平。研究结果有助深入探究CyHV-2基因的表达翻译机制,也为开发基于NF-κB信号通路靶点的新的抗病毒抑制剂提供理论支撑。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72单克隆抗体的制备及应用

鲤疱疹病毒Ⅱ型是引起鲫造血器官坏死病的重要病原。为建立基于抗原水平的免疫检测方法,通过原核表达方法制备鲤疱疹病毒Ⅱ型核衣壳蛋白ORF72,将纯化的ORF72蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选获得单克隆抗体1B3、4B1、4C2、5F4和5H9。免疫印迹分析显示,上述5株单抗均可特异性识别重组蛋白ORF72;免疫荧光分析显示,仅单抗4C2可与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鲫脾脏发生阳性反应。利用单抗4C2通过间接免疫荧光技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鎏金金鱼鳍条细胞系(RyuF-2)后ORF72蛋白表达情况进行检测,结果显示,感染后36 h可检测到阳性信号,并且随着感染时间的延长,细胞中ORF72的表达量明显增加。本试验制备的单克隆抗体4C2为体外进一步探究鲤疱疹病毒Ⅱ型在细胞内的复制机制及建立病鱼免疫检测手段奠定了基础。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66截短蛋白多克隆抗体的制备及互作多肽筛选

为深入探究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在感染过程中的生物学功能,构建了ORF66截短基因的原核表达质粒pET28a-tORF66,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside)16℃诱导蛋白表达,经尿素溶解透析获得溶解的重组蛋白后免疫6周龄小鼠,制备鼠抗tORF66多克隆抗体。将纯化后重组蛋白进行噬菌体展示以此来筛选互作蛋白。经Western Blot检测显示,抗体能够识别感染鲫鳍条细胞系GICF细胞中的鲤疱疹病毒Ⅱ型,效价较高,特异性较好。噬菌体淘选结果通过生物信息学分析显示,得到一条出现频次最高的多肽N′-LHLHQNRMSLSR-C′。该多肽与金鱼基因组中的3个基因有较高的同源性,推断其可能与rORF66重组蛋白相互作用。这将为深入探究ORF66在CyHV-2病毒感染过程中的生物学功能、开发抗CyHV-2病毒新药物及寻找潜在的药物靶点提供新依据。

中药黄白液抑制Ⅱ型单纯疱疹病毒复制的实验研究

目的 :探讨黄白液治疗预防复发性生殖器疱疹的作用。方法 :采用体外细胞培养技术观察黄白液对Ⅱ型单纯疱疹病毒 (HSV 2 )复制的抑制作用 ,并与环胞苷、阿昔洛韦作比较。结果 :黄白液对HSV 2的复制有明显抑制作用 ,其最小有效浓度为2 .5g·L- 1 ,治疗指数为 3 ,黄白液 2 .5g·L- 1 对HSV 2的抑制作用不亚于环胞苷 ,两者抑毒指数为 2 .83 ,阿昔洛韦抗HSV 2作用较强 ,抑制指数为 5 .3 1。结论 :黄白液可治疗复发性生殖器疱疹 ,与其抑制HSV

靶向UL27shRNA抑制Ⅱ型单纯疱疹病毒在HEK293细胞中的复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计原则,针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type2,HSV-2)的UL27基因序列保守区域筛选设计、合成4条干扰靶序列并构建表达UL27序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pGPU6/GFP/Neo.通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞(human embryonic kidney 293 cell)再接种HSV-2.采用实时荧光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR)技术检测UL27各组的mRNA转录水平,终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度,四甲基偶氮唑盐(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,Western印迹法检测蛋白表达效果.结果显示,UL27shRNA75组对UL27基因mRNA表达抑制效果最佳,同时能显著抑制感染细胞的CPE(cytopathic effect,CPE),降低上清液中的病毒感染滴度,提高细胞的生存率,抑制UL27基因的蛋白表达.提示本研究构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27表达载体能在细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL27基因表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制.

鸭疱疹病毒Ⅱ型(暂定名)的分离鉴定

自 1990年以来 ,在福建、浙江和广东等省发生一种以双翅羽毛管淤血呈紫黑色、断裂和脱落以及皮下、脏器 (肝脏、胰脏 )和肠道 (十二指肠、直扬和盲肠 )出血为主要特征的新的鸭传染病 ,暂定名为鸭出血症。我们对从自然感染该病典型病死番鸭脏器中获得的 1株含 2种病毒粒子 (直径大小分别为 30～ 40nm和 80～ 12 0nm)的分离物 ,以Ⅰ型雏鸭病毒性肝炎标准阳性血清进行连续 4代中和后接种番鸭胚 ,收集死亡番鸭胚胚液进行病毒纯化、负染、电镜观察和SPF鸡胚接种试验证明获得单一病毒分离株 (定名为鸭出血症病毒 )。该病毒为不耐酸、不耐碱、不耐热、对氯仿处理敏感、核酸类型为双股DNA的有囊膜病毒 ,直径为 80～ 15 0nm ;对番鸭胚、鹅胚、麻鸭胚、半番鸭胚、北京鸭胚和SPF鸡胚的致死率分别为 10 0 %、10 0 %、78 3 %、6 0 %、82 1%和 0 % ;对 10～ 11日龄番鸭胚的ELD50 为 10 -7.78/ 0 .2ml;无血凝活性 ,不凝集“O”型人、鸭、鸡、鹅、家兔、小鼠 ,豚鼠、猪和绵羊红细胞 ;经血清中和试验证明该病毒与Ⅰ型雏鸭肝炎病毒、雏番鸭细小病毒、雏鹅细小病毒、鸭瘟病毒无血清学相关性。据以上结果可将该病毒确定为疱疹病毒科成员 ,但鉴于其与鸭瘟病毒 (鸭疱疹病毒Ⅰ型 )无血清学相关性 ,则暂定名为鸭疱疹病毒Ⅱ型 ,?

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用

针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。

石榴皮抗Ⅱ型生殖器疱疹病毒的体内外实验研究

用体外细胞培养和实验动物感染模型观察了石榴皮抗Ⅱ型生殖器疱疹病毒（ＨＳＶ－２）作用。体外石榴皮提取液具有多环节的抗ＨＳＶ－２活性，尤以直接灭活和阻碍ＨＳＶ－２吸附效果明显。石榴皮栓剂经阴道内预防性用药，能防止ＨＳＶ－２感染的发生，小剂量石榴皮栓剂（５０ｍｇ）可减轻临床损害，阴道内病毒分泌减少，血清抗体滴度降低。大剂量石榴皮栓剂（１００ｍｇ）则能完全抑制ＨＳＶ－２感染，且ＰＣＲ检测未发现潜伏ＨＳＶ－２ＤＮＡ存在。

虎杖大黄素与黄芪总多糖合用抗Ⅱ型人疱疹病毒药效分析

目的 :为了探讨中药组方时有效成分间的相互作用对药效的影响 ,我们进行了此项研究。方法 :我们以阿昔洛韦 (ACV)为阳性对照 ,采用空斑减数实验 ,用中效作用原理对虎杖大黄素与黄芪总多糖合用抗HSV 2 333株药效进行了分析。结果 :在Hep 2细胞系统中 ,ACV对HSV 2 333株增殖抑制的ED5 0为 10 85ug ml。当大黄素与总多糖以 1(Dm)大黄素 1(Dm)总多糖的比例合用时 ,对HSV 2 333株直接杀灭、感染阻断、增殖抑制的ED5 0依次为 1 5 5ug ml ,0 85ug ml,1.18ug ml;合用指数 (CombinationIndex ,CI)均 <1;相关系数均为 0 99,P <0 .0 0 0 5 ;说明这一合用比对HSV 2333株具有明显的协同对抗作用。结论 :ACV对HSV 2 333株增殖抑制的治疗指数 (TreatmentIndex ,TI)为 10 0。 1(Dm)大黄素 1(Dm)总多糖对HSV 2 333株直接杀灭、感染阻断、增殖抑制的TIs为340 9,6 2 1 6 ,4 47 8,是最佳合用比。

Ⅱ型单纯疱疹病毒培养及gG-2基因特异片段的克隆

目的:通过培养和扩增Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)并提取其全基因组,从而克隆包膜糖蛋白gG-2全长基因及其保守性较高、抗原性较强的特异片段。方法:将HSV-2病毒感染Hela细胞获得大量病毒液,用酚-氯仿法提取病毒全长基因组,并以此为模板扩增编码gG-2的US4基因,再根据氨基酸序列比对结果,选取其特异片段,设计带酶切位点的引物克隆gG-2基因特异片段。结果:成功地获得了大量HSV-2病毒液并提取了病毒基因组,克隆了gG-2全长基因以及特异片段,测序证实,两者均与GenBank中报道的序列相一致。结论:对于遗传特性相对稳定的HSV-2来说,通过病毒感染细胞的方法短时期内获得大量病毒液,并从病毒全基因组中克隆gG-2特异基因片段的方法是可行的,从而为进一步构建gG-2特异片段相关载体、表达相应蛋白奠定了基础。

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。

靶向UL5小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒的抑制

背景:解旋酶-引发酶复合体是Ⅱ型单纯疱疹病毒进行复制的必需基因,UL5基因为Ⅱ型单纯疱疹病毒解旋酶-引发酶复合体的组成单位之一。目的:应用RNA干扰技术分析特异性小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因的干扰作用。方法:以Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因为靶目标,设计、合成5对特异性小干扰RNA。通过LipofeCtamine 2000脂质体将特异性小干扰RNA转染HEK293细胞。48h后行荧光定量RT-PCR检测UL5基因转录水平,终点滴定法测定干扰后病毒滴度,观察其干扰效果。结果与结论:小干扰RNA成功转染入细胞内。荧光定量RT-PCR结果显示,siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低靶mRNA表达,病毒滴度检测结果显示siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度,阴性对照组和siRNA374对病毒感染滴度无影响。针对UL5基因的有效小干扰RNA可以特异性降低Ⅱ型单纯疱疹病毒的复制水平。

敲减单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)UL30蛋白表达可抑制HSV-2复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计要求,选择编码单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶催化亚单位的UL30(unique long 30,UL30)基因序列保守区域,设计、合成并构建表达UL30序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pUL30.通过磷酸钙转染法将其转染入HEK(human embryonic kidney)293细胞中,用蛋白印迹法检测对HSV-2 UL30蛋白表达的影响,观察受染细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),终点滴定法测定细胞上清液中病毒感染滴度(50%tissue culture infective dose,TCID50).结果表明,针对UL30基因的siRNA能有效抑制UL30蛋白表达,同时显著抑制受染细胞的CPE,降低上清液中病毒感染滴度.提示本研究建立的针对UL30基因特异性siRNA能有效阻断HSV-2在HEK293细胞内的复制,UL30基因是一个潜在的抗HSV-2复制的药物靶标.

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。

大青叶提取物抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的体外实验研究

目的检测大青叶提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)的作用。方法以Vero细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)和改良MTT比色法来测定药物的细胞毒性、药物对HSV-Ⅱ的直接灭活作用,以及药物抗HSV-Ⅱ对细胞的吸附和对HSV-Ⅱ在细胞内复制增殖的抑制,算出药物抗HSV-Ⅱ的治疗指数。结果大青叶提取物在体外对HSV-Ⅱ无直接灭活作用,也无抗HSV-Ⅱ吸附细胞的作用,但能抑制HSV-Ⅱ在细胞内的复制增殖,其治疗指数达3.56。结论大青叶提取物在体外有一定的抗HSV-Ⅱ感染效果,主要是通过抑制病毒在细胞内的复制增殖而发挥作用。