Ⅱ型胶原特异性T细胞系与关节炎发病机制的研究

目的 建立Ⅱ型胶原特异性T细胞系 ,研究其对关节炎的诱导作用。方法 通过用弗氏完全佐剂乳化的鸡Ⅱ型胶原 (CCⅡ )皮内免疫注射诱导Wistar大鼠胶原诱导性关节炎 (CIA)。取CIA大鼠肠系膜淋巴细胞在体外用CCⅡ刺激扩增、建立CCⅡ反应性T细胞系。用3 H TdR掺入试验和流式细胞术分别测定其克隆扩增情况和表型格局。观察T细胞系过继转输后Wistar大鼠关节炎的发生情况 ,同时通过肉眼观察和组织化学法鉴定受体大鼠踝关节的病理特征 ;并用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定血清中抗CCⅡ抗体。结果 成功建立T细胞系。通过用荧光素标记抗体作细胞表型分析显示 :所建细胞系 98 2 %为T细胞 ,其中 89 7%为CD4 + T细胞。过继转输试验结果显示 :当注入细胞为 5× 1 0 7时可导致 5 0 %大鼠产生关节炎 ,抗CCⅡ抗体也较对照组明显升高。结论 成功建立T细胞系 ;T细胞系转移关节炎的结果提示 :T细胞在CIA发病机制中具有重要作用。

滑膜抗原特异性调节性T细胞的诱导扩增

目的诱导扩增BALB/C小鼠滑膜抗原特异性调节性T细胞(antigen specific regulatory T cells,sTregs)的产生,为探索滑膜抗原sTregs在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的治疗作用提供实验基础。方法体外诱导培养小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)并负载Ⅱ型胶原蛋白肽,在白细胞介素-2(IL-2)的协同作用下,与小鼠脾CD4^+CD25^+自然发生的调节性T细胞(nTregs)混合培养,以刺激产生滑膜抗原sTregs,并用混合淋巴细胞抑制实验评估扩增的sTregs抑制CD4^+CD25^-T细胞增殖的功能是否具有抗原特异性。结果经DCs刺激1周后,小鼠CD4^+CD25^+Tregs扩增了6倍,并且增殖的sTregs在混合淋巴细胞抑制试验中较多克隆Tregs(Poly-Tregs)具有较强的抑制作用(P<0.01),显示抗原特异性抑制的特点。结论以自身DCs负载滑膜源性抗原(Ⅱ型胶原蛋白肽)可以从小鼠脾CD4^+CD25^+nTregs中诱导扩增滑膜抗原sTregs。

抗骨增生片对兔膝骨关节炎软骨组织形态及Ⅱ型胶原、caspase-3表达的影响

目的观察兔膝骨关节炎使用抗骨增生片后软骨组织及其细胞中Ⅱ型胶原、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3表达的变化。方法随机将30只兔分为正常组10只(A),另20只用来造模。造模组采用膝关节腔内注射1.6%木瓜蛋白酶,造成兔膝骨关节炎模型。造模成功后,再将造模组随机分为模型组(B)、抗骨增生片组(C)(B,C,n=10),C组灌胃0.36 g/kg的抗骨增生片,每日1次;A、B组同法给予等量生理盐水。30 d后,取出兔膝关节软骨,HE染色后观察软骨组织的病理形态,软骨组织中Ⅱ型胶原、caspase-3的表达情况采用免疫组化法检测。结果抗骨增生片组软骨组织破坏程度较模型组明显减轻;C组中Ⅱ型胶原比模型组高(P<0.01)、caspase-3比模型组低(P<0.01)。结论抗骨增生片能抑制兔骨关节炎软骨病理损害的进展,修复损伤软骨可能与其上调Ⅱ型胶原、下调caspase-3的表达,抑制软骨细胞过度凋亡有关。

心脏和软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的基因型鉴定

我们曾经报道了分别在心脏(α-MHC-Cre)和软骨细胞(Col2A1-Cre)特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的成功研制。为了对这2种转基因小鼠进行特异性的基因型鉴定,设计了2对特异性PCR引物,其中一条引物分别位于α-肌球蛋白重链基因(α-MHC)启动子和Ⅱ型胶原(Col2A1)启动子上。以6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA为模板,利用设计的特异性引物以及位于Cre编码区的通用引物进行PCR反应。结果显示,2对特异性引物可以分别将心肌细胞特异性和软骨细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠与其他组织特异性Cre重组酶转基因小鼠有效区分开来。

类风湿关节炎患者Ⅱ型胶原特异性T细胞增殖及抗体生成与HLA-DR4的关系

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者Ⅱ型胶原 (CⅡ)特异性T细胞增殖和CⅡ抗体生成,及与人类白细胞抗原(HLA)- DR_4亚型之间的关系。方法 将CⅡ263 -272十肽与 62例RA患者外周血单个核细胞(PBMC)共孵育 5d,应用四甲基偶氮唑盐法测定T细胞增殖。酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定患者血清CⅡ抗体水平。提取 40例患者外周血基因组DNA,以 33种HLA- DR_4等位基因亚型的特异引物PCR扩增后测定患者HLA DR分型情况。结果 在 62例RA患者中, 38例(61 .3% )患者的T细胞在加入CⅡ263- 272后出现明显增殖,CⅡ263 -272抗体阳性率为 53. 2%。细胞增殖反应阳性的患者CⅡ263- 272抗体的阳性率为 66. 7%,增殖反应阴性的患者为 34 6%,两者比较P<0 .05。CⅡ263 -272抗体阳性的患者T细胞增殖反应率为 69 7%,阴性患者为 42 .1%, 两者比较P<0 .05。所有患者T细胞增殖刺激指数 (SI)与CⅡ263- 272抗体浓度呈显著正相关 (r=0 68,P<0. 01)。40例患者HLA分型中,有 16例携带HLA -DR_4等位基因,未发现HLA DR_4与CⅡ特异性T细胞增殖反应、CⅡ抗体阳性有显著相关性。结论 CⅡ抗体的生成可能与CⅡ特异性T细胞介导的B细胞活化有关。

HLA-DRB1特异性Ⅱ型胶原多肽序列中氨基酸替换对T细胞免疫的影响

目的探讨Ⅱ型胶原(CⅡ)的抗原性多肽CⅡ263～272及其变构肽在T细胞激活中的作用,以筛选可与HLA-DRB1特异性结合,而无或有低T细胞激活作用的CⅡ变构肽,为利用CⅡ变构肽抑制类风湿关节炎(RA)患者的HLA-DRB1限制性T细胞激活提供实验依据.方法采用固相合成法,用丙氨酸和甘氨酸替换CⅡ263～272序列中与T细胞受体结合的氨基酸,并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记这些CⅡ变构肽,观察CⅡ变构肽与抗原呈递细胞表面HLA-DR1分子的结合能力;测定与CⅡ263～272或变构肽共孵育HLA-DR1特异性T细胞株上清液中的白细胞介素(IL)-2浓度,研究CⅡ变构肽在T细胞激活中的作用.结果CⅡ变构肽(269A)可与抗原呈递细胞(L57.23)表面的HLA-DR1分子特异性结合;在HLA-DR1特异性T细胞激活系统中,CⅡ263～272在3.1～5.0μg/ml的浓度下,可明显刺激T细胞激活,而CⅡ变构肽267A,268A,sub269～270,sub267～270未出现或仅有轻度T细胞激活作用(P＜0.01或P＜0.05).结论CⅡ263～272含有与HLA-DR1和与T细胞结合的抗原表位,可以刺激CⅡ特异性T细胞增生,替换与T细胞结合的氨基酸后,变构肽仍可与HLA-DR1结合,但对T细胞激活作用减弱或无T细胞激活作用.

氨基葡萄糖胶囊干预膝骨关节炎患者外周血单个核细胞中软骨代谢相关基因的表达

背景:目前关于氨基葡萄糖的研究多集中于对膝骨关节炎的治疗作用,但关于其对膝骨关节炎患者外周血中软骨代谢相关基因影响的研究有限。目的:观察氨基葡萄糖胶囊对膝骨关节炎的治疗效果及对软骨代谢相关基因表达的影响。方法:选取2017年3月至2019年2月郑州大学附属郑州中心医院收治的90例膝骨关节炎患者,另选取同期医院体检中心收入的40例健康受试者,检测并对比健康受试者与膝骨关节炎患者治疗前外周血单个核细胞中软骨寡聚基质蛋白、Ⅱ型胶原纤维α1、聚糖蛋白、特异性组织抑制物3基因表达水平。采用随机数表法将膝骨关节炎患者分为常规组和研究组,分别给予双氯芬酸钠缓释片、双氯芬酸钠缓释片+氨基葡萄糖胶囊治疗12周,对比治疗前后2组外周血单个核细胞中各基因表达水平、Lequesne指数,统计治疗期间2组不良反应发生情况。结果与结论:①与健康受试者比较,膝骨关节炎患者外周血单个核细胞中软骨寡聚基质蛋白、特异性组织抑制物3 mRNA相对表达量升高(P<0.05),Ⅱ型胶原纤维α1、聚糖蛋白mRNA相对表达量降低(P<0.05);②治疗前研究组和常规组外周血单个核细胞中各基因表达水平比较,差异均无显著性意义(P>0.05);治疗后2组外周血单个核细胞中软骨寡聚基质蛋白、特异性组织抑制物3 mRNA相对表达量均低于治疗前,且研究组低于常规组(P<0.05);治疗后2组外周血单个核细胞中Ⅱ型胶原纤维α1、聚糖蛋白mRNA相对表达量均高于治疗前,且研究组高于常规组(P<0.05);③治疗前研究组和常规组Lequesne指数比较,差异均无显著性意义(P>0.05);治疗后2组Lequesne指数均低于治疗前,且研究组低于常规组(P<0.05);④研究组和常规组不良反应发生率比较,差异均无显著性意义(P>0.05);⑤结果表明,氨基葡萄糖胶囊可有效改善膝骨关节炎患者临床症状且安全可靠,可能通过抑制软骨寡聚基质蛋白、特异性组织抑制物3基因表达,促进Ⅱ型胶原纤维α1、聚糖蛋白基因表达实现的。

足阳明经穴针刺血清对家兔离体胃窦平滑肌细胞舒缩活动的影响

目的:探讨足阳明经穴针刺血清对家兔离体胃窦平滑肌细胞舒缩活动的影响,从离体细胞水平研究足阳明经与胃相关的特异性。方法:将45只家兔随机分为生理盐水组、阿托品模型组、针刺足阳明经穴组、针刺足少阳经穴组、针刺足太阳经穴组,每组9只。分组处理后,颈动脉采血制备针刺血清。另取正常家兔10只,取胃窦平滑肌,经Ⅱ型胶原酶消化后制成正常兔胃窦平滑肌细胞悬液。取1:2稀释的针刺血清与同体积的正常兔平滑肌细胞悬液作用,用戊二醛固定后在显微镜下以测微尺测定细胞长度。结果:阿托品模型组的血清能使正常兔胃窦平滑肌细胞舒张,细胞长度增加;针刺足阳明经穴组的血清可以促进正常兔胃窦平滑肌细胞收缩,细胞长度缩短,而针刺足少阳经穴组和针刺足太阳经穴组的血清对正常兔胃窦平滑肌细胞的长度影响不明显。结论:足阳明经穴针刺血清能使离体胃窦平滑肌细胞产生明显的收缩效应,从离体细胞水平进一步证实了足阳明经与胃相关的特异性。

骨形态发生蛋白-2对椎间盘细胞软骨特异性基因mRNA的调节作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)2对椎间盘细胞软骨特异性基因Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的调控作用。方法应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测BMP2对培养的人椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA表达的调控作用。结果在BMP2浓度为100μg/L(0.149±0.006,P<0.05)和1000μg/L(0.163±0.006,P<0.01)时,其对椎间盘细胞中Sox9基因mRNA可起到显著的正向调控作用;在此浓度下,它也可以对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA起到正向调控作用。结论BMP2可以按照剂量依赖方式正向调控椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达。

类风湿关节炎的基因治疗性疫苗

类风湿性关节炎是一种全身性自身免疫性疾病，Ⅱ型胶原是该病最关键的抗原之一。在患者的血清和关节腔中，均可发现大量的抗Ⅱ型胶原抗体和自身反应性T细胞。自上个世纪90年代起，国际上对类风湿性关节炎新的免疫治疗策略进行了探索，然而，目前国际上的探索仅限于T细胞免疫或T细胞肽疫苗，尚无针对特异性抗原的治疗性疫苗。