改良法构建Ⅱ型重组腺相关病毒介导人TIMP1基因及鉴定

目的改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因的Ⅱ型重组腺相关病毒(rAAV2)。方法采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因,利用基因重组的方法将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点,构建成pSNAV-TIMP1;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418细胞筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-21/rAAV2-TIMP1;用具有rAAV2包装功能的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒(rHSV1-rc/△UL2)感染BHK-21/rAAV2-TIMP1,纯化后得到rAAV2-TIMP1。结果用改良法成功构建rAAV2-TIMP1,病毒滴度达到1×1012v.g./ml。结论成功构建rAAV2-TIMP1,为其进一步应用于基因治疗的研究提供实验基础。

重组Ⅱ型腺相关病毒介导的TIMP-1感染B16细胞对其体外侵袭及体内成瘤性的抑制作用研究

目的研究重组Ⅱ型腺相关病毒(AAV2)介导的TIMP-1对小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16细胞)侵袭性及体内成瘤性的抑制作用。方法重组构建携带金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的AAV2(r AAV2-TIMP1)质粒,以r AAV2-TIMP1体外感染B16细胞,经蛋白质印迹法(Western blotting)检测TIMP-1表达。选择能够明确表达TIMP-1的B16细胞,并根据其对肿瘤细胞侵袭性的抑制作用探究TIMP-1的作用,将感染r AAV2-TIMP1的B16细胞接种至小鼠的皮下与尾静脉,进而观察AAV2介导的TIMP-1对体内成瘤情况的影响。结果 TIMP-1经AAV2成功导入B16细胞并获得有效表达,表明AAV2介导的TIMP1能够明显抑制体外肿瘤细胞的侵袭性,明显降低体内肿瘤细胞的成瘤性。结论 AAV2介导的TIMP1在体外能很好地抑制B16细胞的侵袭性,在体内可以明显抑制肿瘤的形成和生长。

rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能

目的 探讨rAAV 2 HBsAg(表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒 )和rAAV 2 GM CSF(表达粒细胞 /巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒 )共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞 (DC)免疫刺激功能的影响。方法 用rAAV 2 HBsAg和rAAV 2 GM CSF同时感染新分离的树突状细胞 ;CytoTox 96 Non RadioactiveCtoxicityAssay试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)反应 ;混合白细胞反应 (MLR)检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力 ;流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA DR。结果 rAAV 2 HBsAg和rAAV 2 CM CSF共感染的DC刺激同种异体淋巴细胞增值的能力和激发的自身淋巴细胞的CTL效应增强 ,CD83表达水平提高。结论 内源性表达的GM CSF能促进DC成熟。