Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用

目的:构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响。方法:将PKGⅡcDNA片段自载体pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切出,克隆至穿梭质粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ将pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡcDNA片段定向克隆到pAd/CMV/V5-DEST中构建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ)。重组质粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad-PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶(ERK)活性的变化。结果:重组腺病毒滴度达5×109pfu/ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株,PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用。结论:成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础。

Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶在胃癌组织中的表达

目的:探讨Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(tpyeⅡcGMP dependent protein kinase,PKGⅡ)在原发性胃癌组织中的表达及其在胃癌发生发展中的意义。方法:选择50例原发性胃癌组织、50例正常胃黏膜组织,应用免疫组化SP法和逆转录PCR法分别检测PKGⅡ蛋白和mRNA表达水平。结果:PKGⅡ在正常胃黏膜组织中表达较高,在胃癌组织中表达明显降低(P<0.05),相关性分析结果显示PKGⅡ的表达与胃癌细胞的分化程度相关。结论:PKGⅡ在胃癌组织中表达明显降低,可能与胃癌的发生发展有关。

Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶抑制VEGFR2介导的人胃癌HGC-27细胞增殖

目的:探讨Ⅱ型c GMP依赖性蛋白激酶(typeⅡc GMP-dependent protein kinase,PKGⅡ)对血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)介导的人胃癌HGC-27细胞增殖的影响及其作用机制。方法:应用编码PKGⅡc DNA的腺病毒(Ad-PKGⅡ)感染HGC-27细胞,使其高表达PKGⅡ,并以特异性激动剂8-p CPTc GMP激活PKGⅡ。应用血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)激活VEGFR2。MTT法检测细胞增殖;蛋白质印迹法检测p-VEGFR2、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-PKB/p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK1/2)表达;免疫共沉淀法检测PKGⅡ与VEGFR2的结合;免疫沉淀法联合蛋白质印迹法检测PKGⅡ对VEGFR2丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine,Ser/Thr)的磷酸化作用。结果:VEGF-A可促进HGC-27细胞增殖,并诱导胞内p-VEGFR2、p-Akt和p-ERK1/2表达水平明显升高;以Ad-PKGⅡ感染HGC-27细胞使其高表达PKGⅡ并激活后,VEGF-A引起的细胞增殖受到明显抑制,pVEGFR2、p-Akt和p-ERK1/2表达水平显著降低;PKGⅡ可与VEGFR2相互作用,使后者丝氨酸/苏氨酸磷酸化。结论:激活的PKGⅡ可通过使VEGFR2发生丝氨酸/苏氨酸磷酸化抑制人胃癌HGC-27细胞的VEGFR2酪氨酸磷酸化,进而抑制其下游的增殖相关信号转导,最终抑制该细胞的增殖。

分泌型cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ对胃癌细胞增殖相关基因表达的调控

目的:初步探索分泌型cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(typeⅡcGMP-dependent protein kinase,PKGⅡ)对人胃癌HGC-27和AGS细胞株基因表达的影响。方法:采用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对使用谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)标签表达的重组全长人PKGⅡ处理前、后的人胃癌AGS细胞株转录组进行测序;从表达差异明显的基因中筛选与肿瘤细胞增殖相关的基因,采用qRT-PCR法验证在cGMP类似物8-pCPT-cGMP的激活下重组PKGⅡ对相关基因转录水平的影响,并通过蛋白质免疫印迹进一步验证其对相关蛋白表达水平的影响。结果:转录组测序结果显示,579个基因表达有明显差异,其中267个基因表达显著上调,312个显著下调;筛选9个与肿瘤细胞增殖相关的基因进行qRT-PCR检测,证实在GST-PKGⅡ和8-pCPT-cGMP共同作用下,EGF、DFNA5、DACT1、PSCA等mRNA水平在AGS和HGC-27两个细胞株中都表现出与转录组测序一致的趋势(与空白对照组相比P均<0.05);蛋白质免疫印迹结果显示,在GST-PKGⅡ和8-pCPT-cGMP共同作用下,表皮生长因子蛋白水平下调,与转录组测序和qRT-PCR结果一致。结论:分泌型PKGⅡ可从转录水平调控人胃癌HGC-27和AGS细胞中EGF等增殖相关基因的表达,并能够抑制EGF的翻译。

cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ对胃癌细胞BGC-823迁移的影响

目的:研究cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(cGMP dependent protein kinaseⅡ,PKGⅡ)对胃癌细胞株BGC-823迁移活动的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法:以携带PKGⅡ基因的腺病毒结构Ad-PKGⅡ感染胃癌BGC-823细胞,用蛋白质印迹法及免疫荧光检测感染病毒后PKGⅡ的表达。用特异性PKGⅡ激活剂8-pCPT-cGMP作用感染病毒的细胞,通过Boyden槽迁移率、刮除迁移分析法分析PKGⅡ高表达和活性增高对Ras同源性蛋白A(Ras homologA,RhoA)激动剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)诱导的胃癌细胞迁移的影响。结果:胃癌细胞株BGC-823在感染Ad-PKGⅡ后高表达PKGⅡ,经cGMP类似物8-pCPT-cGMP激活后,使RhoA活化诱导的细胞迁移活动受到明显抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PKGⅡ能明显抑制胃癌细胞株BGC-823的迁移。

cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ在癌细胞株中的表达及活性

目的:探讨cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(cGMP dependent protein kinaseⅡ,PKGⅡ)在相同组织来源的正常细胞、转化细胞和癌细胞中的表达及活性的差异。方法:选择相同组织来源的正常细胞、转化细胞株和癌细胞株,通过逆转录PCR和Western blotting分别检测PKGⅡmRNA和蛋白表达水平,用Western blotting检测PKGⅡ底物血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)的磷酸化以反映PKGⅡ的活性。结果:在大鼠和人胃来源的细胞株中,PKGⅡ在转化细胞中表达较高,而在癌细胞的表达明显降低;与之对应的是,PKGⅡ在癌细胞的活性明显低于转化细胞。结论:在相同组织来源的情况下,与转化细胞相比,PKGⅡ在肿瘤细胞中的表达和活性较低。

氧化型钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ——一个新型心脏氧化应激标志物

钙/钙调素依赖性蛋白激酶家族（Ca2 ＋/calmodulindependent protein kinase,CaMK）包括CaMK Ⅰ,CaMKⅡ,CaMKⅢ,CaMKⅣ.其中CaMKⅡ在体内广泛分布,在心肌细胞中高表达.钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作为Ca2＋信号转导的关键因子,调控细胞的多种生物学功能,包括氨基酸和脂质代谢,离子通道/受体及神经递质的合成与释放,维持细胞内钙稳态,调控兴奋收缩耦联作用.

PKGⅡ对乳腺癌MCF-7细胞株中抑癌基因蛋白表达的影响

目的:研究乳腺癌MCF-7细胞株中PKGⅡ对抑癌基因PTEN、p21、p53、BRCA1以及BRCA2蛋白表达的影响。方法:用编码PKGⅡc DNA的腺病毒载体感染MCF-7细胞,使其高表达PKGⅡ并以相应激活剂8-p CPT-cGMP激活;蛋白质印迹法检测MCF-7细胞p53、p21、PTEN、BRCA1以及BRCA2因子表达量。结果:PKGⅡ表达增高并激活后可使乳腺癌MCF-7细胞株中抑癌基因的蛋白表达降低。结论:PKGⅡ通过降低癌细胞的活动水平从而降低抑癌基因蛋白的表达。

IP3R1调控CaMKⅡ和VDAC1在海洛因致心肌细胞节律异常中的作用

目的:探讨1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1)调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)在海洛因(heroin,HE)致心肌细胞节律异常中的作用。方法:联合蛋白组学和GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析心律失常芯片数据,寻找关键调控因子。构建IP3R1基因敲减慢病毒并感染原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs),实验分为对照(control)组、HE组和HE+shIP3R1组。结晶紫染色观察心肌细胞形态;ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平;透射电镜观察线粒体形态学变化;Fluo-4/AM探针法检测细胞内Ca^(2+)浓度;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平;免疫共沉淀(co-immunopre-cipitation,Co-IP)分析IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1蛋白之间的相互作用;Western blot检测IP3R1、CaMKⅡδ、p-CaM-KⅡδ(T287)和VDAC1的蛋白水平。结果:结合蛋白质组学和基因表达谱数据集GSE89410分析,筛选得到80个差异共表达分子,基于基因本体论(Gene Ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果,最终筛选出关键因子IP3R1,且通过STRING数据库获得IP3R1结合蛋白:CaMKⅡδ和VDAC1。Co-IP结果验证IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1存在相互作用,且HE干预后NRCMs中IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1之间的相互作用增强。体外细胞实验显示,与control组相比,HE组NRCMs数量急剧减少,细胞膜变窄,伪足减少,细胞核结构模糊;LDH和AST水平均显著上升(P<0.05);线粒体超微结构损伤严重,证实HE对NRCMs具有毒性作用并导致线粒体损伤。与control组相比,HE组心肌细胞内Ca^(2+)浓度、ROS水平、MMP以及IP3R1、p-CaMKⅡδ(T287)和VDAC1蛋白水平均显著升高(P<0.05),而HE+shIP3R1组这些指标均显著减低(P<0.05);ATP水平则相反。这证实沉默IP3R1表达可减轻HE干预后NRCMs的钙超载及线粒体损伤。结论:IP3R1通过调控CaMKⅡ和VDAC1引起心肌细胞钙超载和ROS生成增多,参与HE诱导的心肌细胞节律异常。

生姜提取物对染铝毒大鼠学习记忆功能和神经细胞结构的影响及其可能作用机制

目的分析生姜提取物(GRE)对铝染毒大鼠学习记忆功能及神经细胞结构的影响,并基于钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、蛋白激酶C(PKC)探讨其可能的作用机制。方法将36只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、铝染毒组、临床药物组、低剂量GRE(L⁃GRE)组、中剂量GRE(M⁃GRE)组、高剂量GRE(H⁃GRE)组,每组6只大鼠。空白对照组大鼠自由饮用不含氯化铝的饮用水,其余组大鼠饮用含10 mg/mL结晶氯化铝的饮用水。3个月后给予空白对照组和铝染毒组大鼠灌胃生理盐水,临床药物组大鼠灌胃盐酸多奈哌齐溶液,分别给予L⁃GRE组、M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠灌胃100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg GRE溶液。持续干预4周后,采用Morris水迷宫实验评估大鼠的学习记忆功能,通过HE染色观察大鼠海马组织形态变化,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测大鼠海马组织CaMKⅡ、nNOS、PKC mRNA和蛋白表达水平。结果(1)与空白对照组相比,铝染毒组大鼠的逃避潜伏期延长且穿越平台次数减少(P<0.05),海马组织的神经细胞皱缩,神经细胞数量明显减少,CaMKⅡ、nNOS、PKC的mRNA表达水平及nNOS、PKC的蛋白表达水平降低(P<0.05)。(2)与铝染毒组比,L⁃GRE组、M⁃GRE组和H⁃GRE组大鼠的逃避潜伏期缩短,临床药物组、M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠的穿越平台次数增加(P<0.05);各给药组大鼠海马组织病理形态有不同程度的改善;临床药物组大鼠的CaMKⅡ、nNOS和PKC mRNA表达水平升高,各剂量GRE组大鼠nNOS和PKC mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。(3)与临床药物组相比,M⁃GRE组和H⁃GRE组大鼠的逃避潜伏期,以及各剂量GRE组的穿越平台次数和目标象限停留时间差异无统计学意义(P>0.05);各剂量GRE组大鼠海马组织病理形态改善程度更为明显;M⁃GRE组、H⁃GRE组大鼠的nNOS、PKC蛋白表达水平升高,L⁃GRE组大鼠的nNOS蛋白表达水平升高(P<0.05)。(4)各剂量GRE组组间大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及目标象限停留时间差异无统计意义(P>0.05);随GRE干预剂量增加,大鼠海马组织病理形态的改善效果越明显;H⁃GRE组大鼠的CaMKⅡmRNA表达水平高于L⁃GRE组(P<0.05)。结论GRE能够改善铝染毒大鼠的神经细胞结构和学习记忆功能,其中对神经细胞结构的改善效果优于盐酸多奈哌齐,对学习功能的改善效果与盐酸多奈哌齐相当。GRE的作用机制可能与拮抗铝所致CaMKⅡ、nNOS和PKC表达水平下降有关。

淫羊藿苷联合糖皮质激素对激素抵抗型肾病综合征模型大鼠的干预作用

目的探讨淫羊藿苷(ICA)联合醋酸泼尼松片(PAT)对激素抵抗型肾病综合征(SRNS)模型大鼠的干预作用。方法雄性SD大鼠用2次注射阿霉素(ADR)法构建SRNS模型。待建模成功后,随机分为模型组、PAT组、ICA组、联合组,每组10只;另取10只大鼠为空白组。空白组和模型组均给予0.9%NaCl;PAT组给予6.3 mg·kg^(-1)·d^(-1)PAT;ICA组给予50 mg·kg^(-1)·d^(-1)ICA;联合组给予6.3 mg·kg^(-1)·d^(-1)PAT+50 mg·kg^(-1)·d^(-1)ICA。5组大鼠灌胃体积均为1 mL·100 g^(-1),每天给药1次,共给药6周。比较各组大鼠的肾功能、血脂水平,用蛋白质印迹法检测钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱα(CaMKⅡα)、丝切蛋白-1(Cofilin-1)和F-肌动蛋白(F-actin)的表达情况。结果空白组、模型组、PAT组、ICA组和联合组的第8周末尿蛋白定量分别为(6.66±1.48)、(178.38±8.96)、(161.56±5.49)、(157.13±8.32)和(96.90±5.05)mg·24 h^(-1),血清肌酸酐分别为(30.90±1.79)、(41.10±2.77)、(34.90±2.03)、(35.10±2.18)和(31.90±2.47)μmol·L^(-1),三酰甘油分别为(0.87±0.14)、(2.30±0.41)、(1.94±0.44)、(1.17±0.59)和(0.89±0.30)mmol·L^(-1),总胆固醇分别为(1.54±0.08)、(2.53±0.22)、(2.14±0.59)、(2.27±0.31)和(1.93±0.32)mmol·L^(-1),CaMKⅡα蛋白相对表达水平分别为0.88±0.09、0.65±0.06、0.71±0.08、0.76±0.07和0.88±0.08,p-Cofilin-1/Cofilin-1比值分别为0.56±0.27、2.52±0.04、0.75±0.02、0.91±0.20和0.53±0.05,F-actin蛋白相对表达水平分别为0.93±0.01、0.64±0.01、0.75±0.02、0.80±0.01和0.85±0.00。模型组的上述指标与空白组和联合组相比,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论ICA联合PAT可通过调控CaMKⅡα/Cofilin-1/F-actin通路改善SRNS大鼠的肾功能、血脂水平,改善肾组织病理结构,促进骨架蛋白重构。

舒郁胶囊对PMDD肝气郁证模型大鼠Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路的影响

目的：观察舒郁胶囊对强迫游泳应激诱导的经前烦躁障碍（premenstrual dysphoric disorder,PMDD）肝气郁证大鼠的影响,探讨L型钙通道（L-type calcium channel,LTCC）Cav1.2亚型介导的钙调蛋白（CaM）/CaMKⅡ信号通路在PMDD肝气郁证发生中的机制。方法：动情周期规律的大鼠进行3次强迫游泳实验,筛选出48只雌性Wistar大鼠进入实验,两次非接受期和接受期悬浮不动时间差值绝对值平均值最小的12只为正常组,其余36只分为模型组、舒郁胶囊组（0.408 g·kg^-1·d^-1）,氟西汀组（2.7 mg·kg^-1·d^-1）。给药组连续给药2个动情周期,模型组和正常组给以等量纯水。采用旷场实验、强迫游泳悬浮不动时间及悬浮不动次数评价模型和药物干预效果。免疫荧光、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测各组大鼠海马脑区中L型钙通道α1C亚型（CACNA1C）,CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的分布及表达。结果：CACNA1C蛋白主要分布在细胞膜上,CaMKⅡ蛋白主要分布在的细胞质内;与正常组比较,模型组大鼠体质量、旷场总路程显著下降（P〈0.05,P〈0.01）,强迫游泳悬浮不动时间、悬浮不动次数显著升高（P〈0.05,P〈0.01）,海马脑区细胞排列散乱,CACNA1C和CaMKⅡ表达升高（P〈0.05,P〈0.01）;与模型组比较,氟西汀和舒郁胶囊组大鼠体质量、旷场总路程明显升高（P〈0.05,P〈0.01）,强迫游泳悬浮不动时间、悬浮不动次数明显降低（P〈0.05,P〈0.01）,海马脑区细胞排列整齐,CACNA1C和CaMKⅡ表达明显降低（P〈0.05,P〈0.01）。结论：利用强迫游泳可成功诱导出PMDD肝气郁证大鼠模型。舒郁胶囊可能通过Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路发挥治疗作用,显著改善PMDD肝气郁证大鼠的行为学变化。

三七总皂苷对大鼠急性重症胰腺炎腺泡细胞钙超载的调节机制

目的探讨三七总皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺组织中钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ-γ(Ca MKⅡ-γ)mRNA表达,降低细胞钙超载的程度,减轻急性重症胰腺炎时胰腺组织的损伤。方法 15只SD大鼠随机分成假手术组(SO组)、急性重症胰腺炎组(SAP组)及三七总皂苷组(PNS组)。采用经肠壁逆行胰胆管注射法建立急性重症胰腺炎大鼠模型,假手术组开腹后仅翻动十二指肠。三七总皂苷组(PNS组)建模前1 h使用腹腔注射三七总皂苷(50 mg/m L血塞通注射液(0.1 m L/100 g)。所有实验分组在建模24 h后处死大鼠留取胰腺组织。使用流式细胞仪检测、分析腺泡细胞内钙离子浓度(使用荧光强度表示钙离子浓度),采用逆转录聚合酶链式反应检测胰腺组织CAMKⅡ-γmRNA表达的变化,并比较各组大鼠胰腺组织病理变化。结果 SAP组和PNS组胰腺组织中CAMKⅡ-γmRNA表达显著增高(P<0.05),PNS组较SAP组CAMKⅡ-γmRNA表达量显著下降(P<0.05)。通过流式细胞仪检测钙离子浓度提示:SO组、SAP组、PNS组三组胰腺细胞内Ca2+的荧光强度具有统计学差异。SAP组和PNS组较SO组大鼠胰腺细胞内Ca2+的荧光强度均有显著升高(P<0.05)。与SAP组相比,PNS组大鼠胰腺细胞内Ca2+的荧光强度均有显著降低(P<0.05)。病理学评分:与SO组相比,PNS和SAP 2组大鼠胰腺组织水平均显著增高(P<0.05)。PNS组大鼠胰腺组织病理学评分显著低于SAP组(P<0.05)。结论 SAP发生时,细胞钙超载程度越高,SAP的病情越重。CAMKⅡ-γ的表达量与胰腺炎病情轻重有关,三七总皂苷(PNS)干预可抑制胰腺细胞内CAMKⅡ-γ的表达,从而缓解胰腺细胞内钙超载,可以减轻胰腺组织病理学改变。

骨髓间充质干细胞来源的微颗粒对心肌肥厚的作用及其机制

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的微颗粒(microparticles,MPs)对心肌肥厚的作用及其机制。方法 对间充质干细胞(MSCs)进行成骨成脂诱导分化,经分离纯化后,透射电镜观察形态特征,流式细胞术鉴定MPs表面抗原。利用异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)诱发建立大鼠心肌肥厚模型,超声心动图检测大鼠心脏结构及功能后,进行心脏及分离的左心室的各项指标检测。将急性分离的大鼠单个心肌细胞分为对照(Control)、心肌细胞肥大(ISO)、MPs、MPs上清液(Supernatant)组,qRT-PCR法检测心肌细胞心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑利钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)mRNA表达量;ELISA法检测心肌细胞钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylated calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,p-CaMKⅡ)表达量;全细胞膜片钳记录各组大鼠单个心肌细胞L-型钙电流(LCa-L)。结果 MSCs成骨分化骨结节经茜素红染色后变成红色,成脂分化脂滴经油红O染色后变成红色;透射电镜下可见MPs膜结构完整,轮廓清晰,直径约200 nm;MPs表面标记物CD29和CD90表达阳性率分别为(98.24±0.82)%和(97.69±1.83)%。与Control组相比,ISO组大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension,LVEDD)明显减少(t=5.065,P <0.05),室间隔舒张末期厚度(interventricular septum end-diastolic dimension,IVSd)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall dimension,LVPWd)、心重-体重比(heart weight to body weight ratio,HW/BW)、心重-胫骨长度比(heart weight to tibial length ratio,HW/Tibia)、左心重-胫骨长度比(left heart weight to tibial length ratio,LV/Tibia)明显升高(t分别为4.013、2.368、4.392、5.043、6.120,P均<0.05),建模成功;ISO组大鼠肥大心肌细胞ANP、BNP mRNA表达量均较Control组明显升高(t分别为25.120、18.261,P均<0.01);经48μg/mL MPs孵育48 h后的MPs组ANP、BNP mRNA表达量较ISO组显著下降(t分别为12.110、3.526,P均<0.05);ISO组CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达水平较Control组显著升高(t分别为3.278、4.181,P均<0.05),MPs组p-CaMKⅡ蛋白表达水平显著下降(t=5.420,P <0.05);ISO组钙电流密度较Control组明显增高(t=15.261,P <0.01),MPs组较ISO组明显降低(t=6.216,P <0.05)。结论 MSC-MPs可显著抑制ISO诱导的大鼠心肌细胞肥大,这一效应与其下调心肌细胞CaMKⅡ、抑制L-型钙通道有关。

尿道狭窄瘢痕中CaMKⅡ、Smad2、CollagenⅠ表达的免疫组化研究

目的:运用免疫组化研究尿道狭窄瘢痕中钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、Smad2、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)表达的差异。方法:本研究样本采集自2014年12月~2015年12月期间,中南大学湘雅医院泌尿外科收治的11例初发性尿道狭窄、10例复发性尿道狭窄患者标本和10例正常尿道组织(取自前尿道狭窄患者的少量正常组织标本)。开展针对正常尿道组织、初发性尿道狭窄瘢痕和复发性尿道狭窄瘢痕的免疫组化研究。结果:(1)通过分析正常尿道组织和尿道狭窄瘢痕组织的苏木精-伊红(HE)染色、VG染色结果发现,尿道狭窄瘢痕组织的HE染色、VG染色切片中成纤维细胞数量较正常尿道组织明显增加,排列较为紊乱。(2)在对比正常尿道组织组和尿道狭窄瘢痕组之间的免疫组化结果后发现尿道狭窄瘢痕组的钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaMKⅡ)、Smad2、CollagenⅠ的表达情况以及胶原蛋白表达量均显著高于尿道正常组(P<0.01)。(3)比较同为尿道狭窄瘢痕组别之间的免疫组化结果发现,复发性尿道狭窄瘢痕组的CaMKⅡ、Smad2的表达量显著高于首发性尿道狭窄瘢痕组(P<0.01)。复发性尿道狭窄瘢痕组的CollagenⅠ表达情况显著高于初发性尿道狭窄瘢痕组(P<0.05)。结论:尿道狭窄瘢痕的发生与CaMKⅡ、Smad2、CollagenⅠ在尿道组织中的表达密切相关。

PKGⅡ阻断EGF/EGFR通路在骨肉瘤中的研究进展

cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(PKGⅡ)是具有特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的膜结合酶。它可以通过阻断表皮生长因子(EGF)/表皮生长因子受体(EGFR)通路抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移,诱导凋亡,抑制EGFR下游关键蛋白的表达,阻断磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路,抑制肿瘤血管的生成,在骨肉瘤的发展中起着重要作用。因此,PKGⅡ是治疗骨肉瘤的潜在靶标。该文综述了PKGⅡ阻断EGF/EGFR通路在骨肉瘤发病机制中的研究进展,旨在为骨肉瘤的靶向联合治疗提供新的思路。