神经肽Y对猪小肠上皮细胞NaPi-Ⅱb蛋白表达及无机磷吸收的影响

本试验通过猪小肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)的体外培养,旨在从细胞水平、基因转录和蛋白表达3个层面探讨不同浓度神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)对猪IEC中Ⅱb型钠磷转运蛋白(Sodium dependent phosphate cotransporterⅡb,NaPi-Ⅱb)的表达及无机磷(Inorganic phosphorus,Pi)吸收的影响,阐释NPY调控Pi吸收的机理,为深入研究动物小肠Pi吸收的分子机制和调控通路提供试验依据。试验设有6个处理,对照组未加NPY,其他处理组添加不同浓度的NPY(10-11、10-10、10-9、10-8和10-7 mol·L-1),每个处理设有6~8个重复,通过噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)比色法检测小肠上皮细胞的增殖情况;通过磷检测试剂盒,采用磷钼酸法测定细胞上清液Pi含量的变化;利用荧光定量PCR技术检测IEC中NaPi-Ⅱb mRNA的相对表达量,采用蛋白质免疫印迹(Western blotting)技术检测NaPi-Ⅱb蛋白的相对表达水平。结果表明:用不同浓度的NPY刺激IEC 24h后,各处理组细胞增殖无显著性差异(P>0.05)。细胞上清液中Pi含量随时间呈显著线性(P<0.01)和二次曲线(P<0.01)下降;在干预24h后,各处理组细胞上清液中Pi含量组间呈现显著性差异(P<0.01),与对照组相比,10-10、10-9、10-8和10-7 mol·L-1处理组上清液Pi含量呈显著性下降(P<0.01),IEC对Pi的吸收量分别提高了161%、171%、168%和139%。NPY添加浓度与NaPi-Ⅱb mRNA和NaPi-Ⅱb蛋白的相对表达量均呈二次曲线关系(P<0.01,P<0.05)。适宜浓度的NPY可以通过刺激小肠上皮细胞NaPi-Ⅱb mRNA的表达,使NaPi-Ⅱb蛋白表达增多,进而诱导细胞外液中无机磷跨膜转运到细胞内液,促进小肠上皮细胞对无机磷的吸收;培养液中NPY的最佳浓度为10-10~10-8 mol·L-1。