根瘤菌Ⅲ型分泌系统的效应蛋白种类及功能

根瘤菌(Rhizobium sp.)是土壤中普遍存在的微生物,可以与豆科植物建立共生关系形成根瘤。共生关系的建立需要复杂的分子交换过程,而根瘤菌的Ⅲ型分泌系统在根瘤菌和豆科植物之间的结瘤和免疫反应中发挥着重要作用。综述了根瘤菌Ⅲ型分泌系统的组成及遗传特性与效应蛋白的合成路径、种类与功能及其在结瘤方面的影响等,为深入了解根瘤菌与寄主植物的结瘤机制提供参考。

Ⅲ型分泌系统分子伴侣研究进展

Ⅲ型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性致病菌中。通过Ⅲ型分泌系统 ,耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、福氏志贺氏菌等革兰氏阴性致病菌注射毒力因子到宿主细胞中 ,被注入的细菌毒力蛋白在宿主细胞中刺激或干扰宿主细胞的代谢过程 ,支配细菌与宿主细胞的相互作用 ,从而引起诸如鼠疫、伤寒、痢疾等许多疾病。Ⅲ型分泌系统分子伴侣在帮助毒力蛋白分泌的过程中起到重要作用。尽管发现Ⅲ型分泌系统分子伴侣至今已近十年 ,但其具体的功能仍不清楚。从分类、功能。

沙门氏菌毒力岛及Ⅲ型分泌系统研究进展

沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌,能引起人和动物多种不同临床症状表现,为人类食物中毒主要病原菌之一。沙门氏菌的侵袭力与毒力岛(pathogenicity island,PI)及其编码的Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)直接相关。本文对沙门氏菌毒力岛、T3SS组成、T3SS分泌及调控机制、T3SS与沙门氏菌致病性、应用研究等进行综述,以期为深入研究提供参考。

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析

克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(T3SS)分子伴侣护航蛋白(Chaperone escort protein)vscO基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,vscO基因全长462 bp,编码153个氨基酸,理论分子量约为18.43 kD,pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质,不存在信号肽,无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区,以及翻译识别信号SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。该氨基酸序列含有多种活性位点,如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。

Ⅲ型分泌装置蛋白HrcJ决定条斑病菌在植物上的过敏反应和致病性的研究

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因编码形成的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS),将致病性效应分子注入水稻细胞中,但Xooc的hrcJ基因在致病性中的作用以及其如何参与形成T3SS分泌装置,并不明确。【方法】本研究根据标记交换原理对Xooc的hrcJ基因进行了敲除。【结果】发现hrcJ突变体丧失在水稻上的致病性和在烟草上的HR激发能力。酵母双杂交显示,HrcJ蛋白N端脂蛋白结构域可与HrcC互作,HrcJ蛋白C端跨膜结构域可与HrcV互作,提示HrcJ蛋白联接于T3SS装置的内膜和外膜之间。功能互补结果显示,缺失脂蛋白结构域和跨膜结构域的hrcJ基因均不能恢复hrcJ突变体在烟草上的HR激发能力和在水稻上的致病性。RT-PCR结果显示,hrcJ的表达受hrpX基因调控,hrcJ基因突变后不影响效应分子hpa1的表达。【结论】hrcJ基因是水稻条斑病菌致病性和非寄主上激发HR的关键因子,其基因产物参与了T3SS装置的形成。

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定

目的重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布。方法以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位。结果从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×10~3的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1∶1 280 000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应。亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质。结论重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质。

致病菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣序列保守性分析及新伴侣的预测

很多革兰氏阴性致病菌使用Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretionsystem,TTSS)将毒力因子直接注射到宿主细胞质中,其中某些效应蛋白(即毒素)需要专一的Ⅲ型分泌系统分子伴侣才能有效分泌。尽管2000年Cheng等提出这些分子伴侣中应该存在保守的氨基酸序列或保守的分泌信号,但是以往的研究并没有发现保守的氨基酸序列或分泌信号。文章作者通过生物信息学模体搜索对45个Ⅲ型分泌系统分子伴侣的氨基酸序列进行分析,找出5个与Ⅲ型分泌系统分子伴侣功能有关的保守模体和模体组合。其中一个为已知的,一个比已知的34氨基酸多肽重复(tetratricopeptiderepeat,TPR)模体更具有Ⅲ型分泌系统分子伴侣SycD家族特征,其他3个为新的模体。每个Ⅲ型分泌系统分子伴侣家族包含一个或多个模体,这揭示了同类分子伴侣序列中确实存在保守的位点,暗示着同类分子伴侣可能存在相同的空间结构和功能,进一步支持了Birtanlan有关相同的空间结构具有普遍TTSS三维分泌信号的假说,并基于此分析和同源分析预测出27个新的可能的Ⅲ型分泌系统分子伴侣。

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白功能域预测

采用PCR法检测了大菱鲆出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌L-49231菌株Ⅲ型分泌系统中的eseB、eseC、eseD基因,经PCR产物克隆测序;利用生物信息学方法对eseB、eseC、eseD表达蛋白的分子量、氨基酸组成、疏水性、跨膜结构、信号肽等进行初步预测和分析。结果显示,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株eseB、eseC、eseD基因分别为:594、934、445bp,与GenBank中登录的迟钝爱德华氏菌PPD FL6-60菌株的eseB、eseC、eseD基因碱基序列的同源性分别为100%、100%、99%。eseB蛋白分子量为21 732.26u,天冬氨酸含量最高,占10.61%;eseC蛋白分子量为53 606.08u,丙氨酸含量最高,占14.43%;eseD蛋白的分子量为21 112.43u,谷氨酰胺含量最高,占11.04%。3种蛋白质中甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸含量都很高,而半胱氨酸、色氨酸含量都很低或缺少。3种蛋白均为亲水性蛋白质。eseB无明显的跨膜结构;eseC在192～210aa、213～233aa、263～284aa处形成3个跨膜区域;eseD在90～106aa处形成一个跨膜区域。3种蛋白均不含信号肽。

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tardaL-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的检测与序列分析

对分离于草鱼、青鱼、鲤鱼、牙鲆、宽体金线蛭、中国林蛙的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hy-drophila),进行Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,TTSS)AscV基因的检测与分析,探讨不同来源嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AscV基因的携带与分布情况。利用文献发表的TTSS的AscV基因特异性引物,采用PCR方法扩增该基因片段,选取代表菌株的AscV基因序列,以DNA Star软件与GenBank公布的参考菌株相应基因序列进行同源性比较,构建系统进化树。结果在供试的42株菌中,有34株携带(阳性率80.95%);其中分离于宽体金线蛭的10株有8株携带(阳性率80%)、中国林蛙的11株有10株携带(阳性率90.9%)、牙鲆的10株有9株携带(阳性率90%)、草鱼的7株有3株携带(阳性率42.9%)、青鱼和鲤鱼的各2株均携带(阳性率100%)。所检测的5个代表菌株AscV基因与参考菌株的同源性在81.0%～98.7%之间;供试不同来源菌株之间的同源性在91.2%～99.3%之间。

铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的研究进展

铜绿假单胞菌是临床常见的重要条件致病菌,具有多种毒力因子,能引起各种急慢性感染。其中最重要的毒力因子是Ⅲ型分泌系统,主动向宿主细胞靶向输送效应蛋白,引起宿主细胞的病理变化,并逃避免疫细胞的降解。研究Ⅲ型分泌系统不仅有助于明确铜绿假单胞菌的致病机制,更重要的是为临床治疗及新药研发提供新思路。

Ⅲ型分泌系统及其抑制剂的研究进展

细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重点。致病菌为在宿主体内生存、繁殖、扩散,会分泌一些蛋白性质的毒性因子。目前认为革兰阴性致病菌在长期进化过程中形成入侵宿主细胞的特异性分泌系统共有5种类型(Ⅰ~Ⅴ型),其中最显著的是细菌Ⅲ型分泌系统(type three secretion system,T3SS),与细菌致病性密切相关。T3SS抑制剂的策略是细菌分泌毒力蛋白,阻止其对宿主细胞的侵染。本文对细菌T3SS的组成、T3SS抑制剂筛选系统、T3SS抑制剂以及作用机制等进行综述,为深入研究以T3SS为靶点的药物设计提供参考。

沙门氏菌毒力岛及其Ⅲ型分泌系统

沙门氏菌含两个编码三型分泌系统的毒力岛(SPIs),每个毒力岛编码一个Ⅲ型分泌系统。SPI1与细菌的侵袭性有关,而SPI2与系统感染和沙门氏菌在真核细胞中的聚集有关。本文对SPI1和SPI2的分子结构、Ⅲ型分泌系统的功能、基因表达的调节及SPI1和SPI2的进化进行了综述。

细菌Ⅲ型分泌系统的研究进展

许多革兰氏阴性细菌借助于细菌的分泌系统来发挥其毒性。革兰氏阴性细菌有5种类型蛋白分泌系统（Proteinsecretionsystem），即Ⅰ—Ⅴ型。其中，Ⅲ型分泌系统与细菌的致病性密切相关。Ⅲ型分泌系统广泛存在于动、植物致病菌中。在动物致病菌中，胞外菌利用Ⅲ型分泌系统黏附在宿主细胞表面，然后跨越胞膜将特异性蛋白注入宿主细胞内，而存在于空泡中的细菌也利用此系统穿越空泡膜注入蛋白质，从而来调节宿主细胞的功能。研究该分泌系统可能会发现新药的靶子，理解该分泌途径可能对于高毒性的或不稳定的成分的靶向运输等都有重要意义，Ⅲ型分泌系统正日益受到微生物学者的重视。

铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统的分子调控机制

铜绿假单胞菌是临床上重要的革兰氏阴性条件致病菌。通过Ⅲ型分泌系统,铜绿假单胞菌将其毒力因子注入到真核宿主细胞内部,逃避宿主巨噬细胞的吞噬降解,引起宿主相应的病理变化,是铜绿假单胞菌感染致病的重要原因。本文在简单介绍铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统组成和功能的基础上,主要对调控T3SS基因转录表达的分子机制的研究进展进行综述和讨论。

中山地区铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒力基因表达差异的检测

目的分析中山地区铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)毒力基因表达及耐药情况,为临床抗感染治疗提供依据。方法对中山市人民医院2016年7-11月临床分离的铜绿假单胞菌随机选取76株,采用PCR法检测分离菌株exoU、exoS、exoT、exoY 4种毒力基因;采用Vitek2Compact全自动微生物鉴定仪测定细菌对抗菌药物的敏感性。结果 exoS、exoY检出率最高,分别为52.6%(40/76)、63.2%(48/76);主要为exoU(-)exoS(+)exoT(-)exoY(+)基因型,占59.26%;多重耐药及非多重耐药铜绿假单胞菌株4种毒力基因的阳性率无显著性差异;TTSS阳性组对13种药物的耐药率普遍低于TTSS阴性组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论铜绿假单胞菌毒力基因携带存在一定的地域性差别;多重耐药及非多重耐药铜绿假单胞菌株毒力基因携带情况相似。