南极eelpout(Lycodichthys dearborni)多聚体Ⅲ型抗冻蛋白基因的克隆及进化分析

冰冻海洋中生存的南极eelpout(Lycodichthysdearborni)体内能合成高浓度的Ⅲ型抗冻蛋白(AFPⅢ)。为了寻找新的AFPⅢ基因,构建了L.dearborni肝脏cDNA文库。通过斑点杂交筛选此文库,发现一个2.87kb 的cDNA克隆,LD12。序列分析采用DNAssist2.0和ClustalX1.8软件。结果显示,LD12分子由12个串联重复的片段构成,每一个片段编码一个61个氨基酸(aa)的Ⅲ型抗冻蛋白分子和一个9aa的连接子。这是第一次在合成AFPⅢ的极地鱼类中发现这样的多聚蛋白结构基因。有趣的是,组成、结构和起源都不相同的抗冻糖蛋白AF GP,其基因也呈现类似的多聚蛋白结构的现象。因此,这种独特的多聚基因结构可能是鱼类基因组在适应极端寒冷的环境中采取的一种普遍方式。

南极鱼Ⅲ型抗冻基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

为了探讨多聚AFPⅢ的作用机制,从南极鱼Lycodichthys dearborni的多聚三型抗冻蛋白基因LD12 c DNA中克隆得到AFPⅢ的四聚体,命名为LD4,并构建真核表达质粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。将表达质粒转染到斑马鱼细胞系ZF4中,发现LD4可以在ZF4中大量表达并且能够减少斑马鱼细胞在低温胁迫下的死亡率。通过对不同处理温度(28、18、10℃)下的WT、EGFP和LD4细胞进行转录组测序分析,找出26个表达差异转录因子,其中I3MB13、ZNF687b等表达上调,JUN、Cremb等表达下调,并且通过荧光定量PCR的验证。通过KEGG pathway分析发现,这些差异性基因主要参与细胞凋亡、细胞周期、增殖等调节通路。采用Annexin V-PE/7-AAD双染色法对3种不同温度下的WT、EGFP和LD4细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,LD4在低温下与对照组相比凋亡率没有显著差异,说明LD4可能是通过其他通路而不是通过抑制细胞凋亡来抵御低温胁迫,这为LD4作用机制的进一步研究提供了理论基础。