表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在肝细胞癌中的表达及意义

背景与目的有许多证据表明表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)在一系列恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,但EGFRvⅢ与肝癌的关系目前尚未明确。本研究旨在探讨EGFRvⅢ在人肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)癌组织中的表达,并分析其意义。方法用免疫组化SP方法检测55例HCC癌组织及癌旁肝组织中EGFRvⅢ的表达。结果HCC癌组织中EGFRvⅢ的阳性率(61.8%,34/55)高于癌旁肝组织中的阳性率(38.2%,21/55),两者间有显著性差异(P<0.05)。人肝癌组织中EGFRvⅢ蛋白的检出率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发、肿瘤直径大小呈显著性相关,而与肿瘤数目、分化程度、血清AFP水平或HBsAg状况、癌旁肝硬化无显著性相关。结论EGFRvⅢ在肝癌组织中有较高表达,且与肝癌的发展及术后复发等有关。

表皮生长因子受体及Ⅲ型突变体在食管癌的表达及意义

背景与目的:已有研究显示表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRv Ⅲ)在一系列恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,但EGFR、EGFRvⅢ与食管癌的关系目前尚未明确。本研究探讨EGFR及EGFRvⅢ与食管癌组织发生发展的关系。方法:应用免疫组织化学及蛋白印迹实验(Western Blot)检测66例人食管癌组织及癌旁正常组织EGFR及EGFRvⅢ表达,评价EGFR及EGFRvⅢ在食管癌患者的性别、年龄、TNM分期及病理分级等临床参数组的表达分布。Pearson相关性检验分析EGFR及EGFRvⅢ表达相关性。结果:免疫组化显示EGFR、EGFRvⅢ在肿瘤组织表达的平均灰度净值分别为25.4±3.2、22.5±4.2,在癌旁正常食管组织平均灰度净值分别为5.0±3.5、5.5±3.0,肿瘤组织与正常组织相比差异均有显著性(P<0.000)。Western Blot显示EGFR、EGFRvⅢ在肿瘤组织表达的平均灰度净值分别为1.37±0.41、0.83±0.15,在瘤旁正常食管组织平均灰度净值分别为0.21±0.09、0.08±0.05,肿瘤组织与正常组织相比差异均有显著性(P<0.05)。在性别、年龄、肿瘤大小和生长方式方面EGFR、EGFRvⅢ的表达分布差异均无显著性(P>0.05),而在TNM分期、病理分级和淋巴结转移方面两者差异均有显著性(P<0.05)。免疫组化检测两蛋白表达净灰度值相关系数r为0.701(P<0.0001),Western Blot检测两种蛋白表达相关系数r为0.556(P=0.031)。两种研究方法均提示EGFR与EGFRvⅢ在食管癌中的表达成较好线性正相关性。结论:EGFRvⅢ在食管癌特异性表达,EGFR与EGFRvⅢ在食管癌中的表达呈线性正相关,提示EGFR与EGFRvⅢ与食管癌发生、发展密切相关。

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子质量为28000左右。ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性。结论成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体。

表皮生长因子受体和表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在胆囊癌中的表达及意义

目的检测胆囊癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)和表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)蛋白表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测52例胆囊癌组织及50例慢性胆囊炎组织中EGFR和EGFRvⅢ蛋白表达情况,分析EGFR和EGFRvⅢ蛋白表达与胆囊癌患者临床病理特征的关系。结果胆囊腺癌和慢性胆囊炎组织中的EGFR阳性表达率分别为46.6%和20%(P=0.005);胆囊腺癌中EGFRvⅢ的阳性表达率为28.8%,慢性胆囊炎组织未见EGFRvⅢ阳性表达(P=0.000)。EGFR和EGFRvⅢ蛋白在胆囊腺癌中表达呈正相关(r=0.517,P=0.000)。EGFR表达与胆囊腺癌组织分化、T分期相关(P<0.05);EGFRvⅢ阳性表达与胆囊腺癌组织分化、T分期、淋巴结转移、远处转移相关(P<0.05)。EGFR与EGFRvⅢ阳性表达胆囊癌患者总体生存显著低于阴性表达患者;EGFRvⅢ阳性表达、淋巴结转移是评估胆囊癌预后独立因素。结论胆囊癌组织中EGFR与EGFRvⅢ蛋白高表达,与胆囊癌分化程度、淋巴结转移等临床指标相关,可能成为胆囊腺癌诊断、治疗及评估预后的有效指标。

EGF受体Ⅲ型突变体在肿瘤治疗中的研究进展

EGFRⅢ型变异体 (或EGFRvⅢ )是一种新型的肿瘤特异性靶点。EGFRvⅢ是正常分子经过遗传学重排成为肿瘤特异性靶点的最好例证。由于仅在肿瘤细胞中发现EGFRvⅢ ,可以应用它设计靶向性药物选择性治疗肿瘤 ,而不影响正常细胞 ,避免传统治疗中所见的副作用。以表达EGFRvⅢ的细胞为靶点的治疗方式有三种 :1 )作为毒性抗体或修饰病毒的直接靶点 ,2 )利用EGFRvⅢmRNA的特异性核酶或EGFRvⅢ及其下游信号传导分子的特异性抑制剂进行治疗 ,3)利用EGFRvⅢ触发免疫反应。概括介绍了肿瘤特异性标记物EGFRvⅢ在肿瘤治疗中的研究进展。

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。

白藜芦醇对过表达EGFR的Ⅲ型突变体的胶质瘤细胞的生长抑制作用

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对过表达EGFR的Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的U87人脑胶质瘤细胞(U87-EGFRvⅢ)的生长抑制作用。方法:将不同浓度的Res作用于U87-EGFRvⅢ或U87细胞,用MTT法检测Res对细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡作用,免疫印迹法检测Res作用后细胞内EGFRvⅢ的表达情况。结果:经不同浓度Res处理后的U87-EGFRvⅢ细胞和U87细胞均显示抑制细胞生长的作用(P<0.05);流式细胞仪显示不同浓度Res对U87-EGFRvⅢ有促凋亡作用,显著高于对照组(P<0.05),100μmol/L和200μmol/L Res的48 h的细胞凋亡率分别为20.1%±0.8%、46.9%±1.2%;免疫印迹法显示Res作用后U87-EGFRvⅢ细胞内的EGFRvⅢ的表达量显著下降。结论:Res可诱导U87-EGFRvⅢ细胞凋亡、抑制其细胞增殖,并可使细胞内的EGFRvⅢ表达下降。

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。

表皮生长因子受体及其Ⅲ型突变体在人食管癌的表达及意义

目的检测表皮生长因子受体(EGFR)及表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)在人食管癌组织中的表达,探讨其与食管癌发生、发展的关系及其与各临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学染色法(Maxvision TM二步法)检测食管癌组织及正常食管组织中EGFR和EGFRvⅢ蛋白的表达水平,并将检测结果与临床病理参数进行综合分析。结果食管癌组织EGFR和EGFRvⅢ的表达率分别为65.6%、58.5%,正常食管黏膜EGFR和EGFRvⅢ表达率为30.0%、0%。EGFR在食管癌组织的表达明显高于正常食管组织(P<0.01),EGFRvⅢ在正常食管黏膜不表达。二者在食管癌组织的表达与性别、年龄、肿瘤大小和生长部位均无相关(P>0.05),与食管癌的分化程度、淋巴结转移、远隔器官转移及临床分期相关(P<0.05)。结论EGFR、EGFRvⅢ过度表达可能与食管癌的发生发展密切相关,EGFR、EGFRvⅢ有望作为预测食管癌预后的候选基因,EGFRvⅢ在食管癌组织中特异性表达,可能使其成为食管癌治疗的理想的靶点。

靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的第三代嵌合抗原受体的构建与表达

目的:构建第三代靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的嵌合抗原受体表达载体,为肿瘤过继免疫治疗提供实验基础。方法:运用分子克隆方法将嵌合抗原受体的胞外抗原结合区(EGFRvⅢ单克隆抗体的轻链和重链可变区,EGFRvⅢsc Fv,726 bp)、铰链区/穿膜区(213 bp)、共刺激分子(CD28和CD137的胞内信号区,123 bp和126 bp)和免疫受体酪氨酸活化基序(CD3ζ链,336 bp)连接成EGFRvⅢsc Fv-CD28-CD137-CD3ζ(EGFRvⅢ/3CAR),克隆入真核表达载体p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP的EcoRⅠ和Bam HⅠ位点,转染293T细胞48 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting检测EGFRvⅢ/3CAR的表达。结果:EGFRvⅢsc Fv和基因合成的CD28-CD137-CD3ζ表达框通过重叠延伸PCR拼接成EGFRvⅢ/3CAR,限制性内切酶片段分析和DNA测序均验证了重组载体序列完全正确,Western blotting应用抗人-CD3ζ抗体检测到EGFRvⅢ/3CAR在293T细胞中的完整表达(相对分子质量约58 k D)。结论:成功构建嵌合抗原受体EGFRvⅢ/3CAR表达载体,为嵌合抗原受体修饰T细胞靶向治疗肿瘤提供研究基础。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在卵巢癌中检测及靶向治疗的研究进展

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)作为最常见的表皮生长因子受体(EGFR)基因突变类型,只表达于恶性肿瘤,而不表达于正常组织中,是肿瘤特异性标志物,可作为卵巢癌靶向治疗的靶点。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体及血小板衍生生长因子-D在结肠癌组织中的表达及对靶向治疗的作用分析

目的探究表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)及血小板衍生生长因子-D(PDGF-D)在结肠癌组织中的表达及对靶向治疗的指导作用。方法选取2016年1月2017年6月于我院行结肠癌根治术的患者60例,收集其标本作为观察组,另取正常结肠组织20例作为对照组。采用免疫组织化学技术及蛋白质印迹法检测组织中的EGFRvⅢ和PDGF-D,比较结肠癌和正常结肠组织中上述2指标的表达差异及影响表达的因素。结果观察组EGFRvⅢ和PDGF-D的阳性表达率及含量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌中的表达与性别和年龄无关,而同分化程度和临床病理分期(TNM)有关,分化程度低、TNM分期高的标本EGFRvⅢ和PDGF-D阳性表达程度及含量均高于分化程度高、TNM分期低的标本,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.647,P<0.05)。结论 EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌组织中表达显著增加,且同分化程度和TNM分期有关。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在胶质瘤中的研究进展

胶质瘤是临床最常见的原发中枢神经系统恶性肿瘤之一,治疗难度较大且预后较差。表皮生长因子受体(EGFR)的异常活化及突变在胶质瘤的发生发展、治疗中均发挥了重要作用,表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)是其最常见的突变形式。近年来,随着肿瘤免疫治疗的发展,越来越多的研究发现EGFRvⅢ为胶质瘤的免疫治疗提供了重要靶点,包括单克隆抗体、肿瘤疫苗和过继性T细胞治疗。本文对近年来EGFRvⅢ在胶质瘤中表达及与患者治疗、预后间的关系进行综述。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在原发性胆囊癌中的表达及其意义

目的检测表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）在原发性胆囊癌中的表达，探讨其与胆囊癌发生的关系。方法采用免疫组化SABC法检测68例原发性胆囊癌病人中EGFRvⅢ的表达水平，并运用免疫组化图像分析法进行半定量。结果原发胆囊癌组织EGFRyⅢ表达的总阳性率为53％，其中腺癌的阳性率为51％。依据病理分级，EGFRvⅢ表达水平由高到低分别为Ⅲ级〉Ⅱ级〉Ⅰ级，其差异具有统计学意义（q=2．49，P=0．02，q=3．63，P〈0．01，q=5．69，P〈0．01）。不同性别者EGFRvⅢ表达水平无显著差异（t=1．29，P=0．20）；EGFRvⅢ表达与年龄无显著相关性（r=0．03，P=0．88）。结论EGFRvⅢ在原发性胆囊癌组织存在高表达，对胆囊癌的发生、发展起一定作用。

嵌合抗原受体表皮生长因子受体Ⅲ型突变体单链抗体-ICOS-CD3ζ表达载体的构建与鉴定

目的 构建嵌合抗原受体表皮生长因子受体Ⅲ型突变体单链抗体（EGFRvⅢscFv）-ICOS-CD3ζ表达载体.方法 将靶向EGFRvⅢscFv（726 bp）与第2代嵌合抗原受体的铰链区、跨膜区、胞内信号区（Hinge-TM-ICOS-CD,648bp）通过重叠延伸聚合酶链反应（PCR）连接,克隆入表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点,测序确定DNA序列正确后脂质体法转染293T细胞,Western blot检测目的基因表达.结果 EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切和DNA测序显示嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-ICOS-CD3ζ各基因片段连接及序列正确,转染293T细胞48h后提取蛋白质,鼠抗人CDζ单抗免疫印迹显示目的基因为57×103的蛋白条带,与预算相对分子质量相符.结论 成功构建嵌合抗原受体EGFRvⅢscFv-ICOS-CD3ζ表达载体,为表达EGFRvⅢ的肿瘤靶向免疫治疗提供了研究基础.

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在胃癌的表达及其临床意义

目的检测表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）在胃癌组织中的表达，探讨其与胃癌发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学染色法（Maxvion 二步法）检测胃癌组织及正常胃组织中EGFRvⅢ蛋白的表达水平，并将检测结果进行统计学分析、比较。结果胃癌组织EGFRvⅢ的阳性表达率为60．34％，正常胃黏膜EGFRvⅢ表达率为0，胃癌组织表达明显高于正常胃组织（P〈0．01）；EGFRvⅢ的表达与性别、年龄和肿瘤生长部位均无相关性（P〉0．05）。结论EGFRvⅢ过度表达可能与胃癌发生发展密切相关，EGFRvⅢ在胃癌组织的特异性表达，可能使其成为胃癌治疗的理想的靶点。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体靶向治疗乳腺肿瘤的研究进展

以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为靶点的抗肿瘤研究已取得了令人瞩目的进展，但其存在于人正常组织，特异性较差。现已知EGFR存在多种突变体，其中最常见的是表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor type Ⅲ variant，EGFRvⅢ）。EGFRvⅢ在50％～78％的乳腺癌中有表达^[1]。

靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体的嵌合抗原受体修饰T细胞对肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用

目的观察靶向表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的嵌合抗原受体修饰T细胞(EGFRvⅢ/2CAR-T)对肝癌细胞SMMC-7721的特异杀伤作用。方法二代EGFRvⅢCAR表达框(EGFRvⅢ/2CAR,1374bp)克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的XbaⅠ和BamHⅠ位点,转座子载体(PB-EGFRvⅢ/2CAR)和转座酶双质粒电穿孔(1×20ms,840V)转导人外周血T细胞,流式细胞术检测EGFRvⅢ/2CAR表达。Westernblot法检测SMMC-7721中EGFRvⅢ表达。EGFRvⅢ/2CAR-T细胞和SMMC-7721细胞共培养,乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测特异杀伤作用、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测干扰素(IFN)-γ分泌水平。结果重组载体PB-EGFRvⅢ/2CAR经XbaⅠ和BamHⅠ酶切、电泳分析及DNA测序证明基因片段连接无误、核酸序列正确。流式细胞术检测结果转座子/转座酶双质粒电穿孔外周血T细胞EGFRvⅢ/2CAR表达率为55.5%。Westernblot显示SMMC-7721在相对分子质量145000处EGFRvⅢ表达。EGFRvⅢ/2CAR-T和SMMC-7721共培养24h,LDH释放试验证明肿瘤特异性杀伤,与效靶比呈正比(E∶T为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1);ELISA检测到IFN-γ分泌量为(1060.1±89.0)pg/ml,明显高于对照组(P=0.000)。结论靶向EGFRvⅢ的二代CAR-T细胞能够特异杀伤EGFRvⅢ+的肝癌细胞SMMC-7721。

针对表皮生长因子受体III型突变体靶向治疗肿瘤的研究进展

表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)在许多类型肿瘤的发生发展中具有重要作用,它仅表达于肿瘤细胞,而正常细胞不表达,因此成为肿瘤治疗的理想靶点。现对EGFRvIII在肿瘤研究中的进展作一综述。

双特异性CAR-T细胞对EGFRvⅢ^(+)/CD133^(+)胶质瘤干细胞的靶向杀伤

目的:制备双特异性CAR-T(bs CAR-T)细胞,观察其对表达表皮生长因子Ⅲ型突变阳性(EGFRvⅢ^(+),简称vⅢ^(+))和CD133^(+)胶质瘤干细胞的靶向杀伤作用。方法:基于前期研制的vⅢ/CD133双特异性微抗体和二代CAR构建的双特异性CAR(bs CAR),制备慢病毒载体转染人外周血T细胞,FCM和WB法检测bs CAR转染效率和表达水平。bs CAR-T细胞和vⅢ^(+)/CD133^(+)U87胶质瘤干细胞共培养,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验、IFN-γ分泌实验检测其特异性杀伤作用和对IFN-γ分泌的促进作用。制备裸鼠vⅢ^(+)/CD133^(+)U87干细胞移植瘤模型检测bs CAR-T细胞对移植瘤生长的抑制作用。结果:vⅢsc Fv和CD133sc Fv通过重叠PCR无缝连接入二代CAR表达框(S-vⅢscFv/CD133scFv-Hinge-TM-CD137-CD3ζ)中,然后克隆入p CDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP载体的Eco RⅠ和Bam HⅠ位点(pbs CAR)。3种质粒(p VSV-G、p CMV-d R8.9和pbs CAR)共转染HEK293T细胞制备慢病毒载体,转染外周血T细胞,FCM检测bs CAR表达率为71.1%,WB法结果显示bs CAR表达正确。bs CAR-T细胞和vⅢ^(+)/CD133^(+)U87干细胞共培养检测结果显示,bs CAR-T细胞对胶质瘤干细胞具有特异性杀伤作用,与效靶比呈正比;IFN-γ分泌量为(2350.6±92)pg·m L^(-1),明显高于对照组(P<0.01)。裸鼠移植瘤动物模型显示,bs CAR-T细胞在体内具有明显的移植瘤抑制作用(P<0.01)。结论:bs CAR-T细胞能够特异性靶向杀伤vⅢ^(+)/CD133^(+)胶质瘤干细胞,实验结果为促进实体瘤的细胞免疫治疗提供了实验依据。