Ⅲ型纤连蛋白样包含结构域1蛋白在食管癌组织中的表达及临床意义

目的研究Ⅲ型纤连蛋白样包含结构域1(FNDC1)蛋白在食管癌组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组化及实时荧光定量PCR检测四川省巴中市中心医院2013年4月至2015年4月诊治的93例食管癌患者癌组织及癌旁组织中FNDC1的表达,分析癌组织中FNDC1的表达与临床病理特点关系。随访5年,Kaplan-Meier生存分析癌组织中不同FNDC1表达患者预后的差异。结果癌组织中FNDC1 mRNA的相对表达量明显高于癌旁组织(P <0.05)。FNDC1阳性棕褐色染色主要位于癌组织中肿瘤细胞的细胞浆,癌组织中FNDC1的阳性表达率明显高于癌旁组织(P <0.05)。癌组织中FNDC1蛋白表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关(P <0.05)。随访3~60个月,FNDC1阳性患者5年总体生存率低于FNDC1阴性患者(P <0.05),FNDC1阳性患者的平均生存时间短于FNDC1阴性患者(P <0.05)。结论食管癌组织中FNDC1表达升高,FNDC1的表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关,并有可能成为判断食管癌患者生存预后的标志物。

Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5抑制巨噬细胞焦亡的作用机制

背景:Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)是一种肌肉因子,具有调节糖脂代谢、抗炎、抗氧化及改善胰岛素抵抗等功能,并且具有调节多种细胞焦亡的能力。目的:探讨FNDC5对巨噬细胞焦亡的作用及潜在机制。方法:(1)构建FNDC5基因过表达和沉默慢病毒载体,将慢病毒载体转染至THP-1细胞株,通过观察细胞绿色荧光表达、qPCR和Western blot验证转染效果。(2)佛波酯诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,通过氧化性低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)构建巨噬细胞焦亡模型,分组:NC组、ox-LDL组、ox-LDL+MOCK1组、ox-LDL+Ov-FNDC5组、ox-LDL+MOCK2组和ox-LDL+shFNDC5组。(3)采用Hoechst 33342/PI荧光双染和乳酸脱氢酶释放实验评估细胞焦亡程度,采用qPCR和Western blot检测相关分子mRNA和蛋白表达水平,采用ELISA检测细胞上清液中白细胞介素1β和白细胞介素18释放水平。结果与结论:与ox-LDL+MOCK1组相比,过表达FNDC5可显著降低巨噬细胞焦亡率以及乳酸脱氢酶、白细胞介素1β、白细胞介素18释放水平,显著抑制NF-κB p65、NF-κB p50、NLRP3、ASC、Caspase-1及GSDMD的mRNA表达,显著抑制NF-κB p65、NF-κB p50、NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1及GSDMD-N的蛋白表达;与ox-LDL+MOCK2组相比,沉默FNDC5则出现相反结果。结果表明:FDNC5可能通过抑制NF-κB/NLRP3通路缓解巨噬细胞焦亡。

构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体抑制内皮细胞凋亡

背景:Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5是一种调节糖脂代谢的蛋白分子,可以调控细胞凋亡,且参与抑制动脉粥样硬化的进程。目的:通过构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体,转染人脐静脉内皮细胞,验证Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5调控内皮细胞凋亡的作用。方法:构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体。取处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞,分3组培养:空白组不进行慢病毒转染,对照组转染不含Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5基因的空载体慢病毒,实验组转染Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒,转染7 d后,采用RT-PCR和Western blot检测Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5的mRNA与蛋白表达。转染7 d后,向3组细胞内加入氧化型低密度脂蛋白溶液,采用CCK-8法测定细胞活力,Hoechst 33342/PI双染及流式细胞技术检测细胞凋亡程度。结果与结论:①实验组Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5的mRNA与蛋白表达均高于空白组、对照组(P<0.05);②CCK-8检测显示,实验组加入氧化型低密度脂蛋白1,2 h的细胞活力高于空白组、对照组(P<0.05),3组加入氧化型低密度脂蛋白4 h的细胞活力比较差异无显著性意义(P>0.05);③加入氧化型低密度脂蛋白24 h后,流式细胞术检测显示实验组细胞凋亡率低于空白组、对照组(P<0.05),Hoechst 33342/PI双染显示实验组凋亡细胞数量少于空白组、对照组;④结果表明,过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5可以抑制人脐静脉内皮细胞的凋亡。

Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5通过抑制ERK1/2磷酸化抑制C3H10T1/2细胞成脂分化

旨在探究Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(typeⅢdomain-containing protein5,FNDC5)对C3H10T1/2细胞成脂分化的调控作用。利用qRT-PCR和Western印迹检测FNDC5在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中的时序性表达规律;构建慢病毒包被的过表达/干扰FNDC5载体,转染C3H10T1/2细胞,采用qRT-PCR检测成脂分化关键基因的表达情况,油红O染色检测脂滴含量,利用Western印迹检测细胞外信号调节激酶(extracellularregulatedkinase1/2,ERK1/2)及磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)的表达水平。C3H10T1/2细胞成脂诱导分化8d,Fndc5的表达量明显升高(P<0.05);C3H10T1/2细胞中过表达FNDC5,成脂分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)和CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha, C/EBPα)的表达量显著降低(P<0.01),CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer binding protein beta, C/EBPβ)表达量明显降低(P<0.05),脂滴含量明显减少,P-ERK1/2的含量明显降低(P<0.05)。C3H10T1/2细胞中干扰FNDC5,成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPβ、FABP4和C/EBPα的表达量显著升高(P<0.01),脂滴含量明显增加,P-ERK1/2的含量明显升高(P<0.05)。本研究发现,FNDC5可以通过抑制ERK1/2的磷酸化水平,抑制C3H10T1/2细胞的成脂分化,为FNDC5调控脂肪沉积的机制研究提供参考数据。

妊娠糖尿病患者血清S100A4、FNDC5水平及其与妊娠结局的关系

目的 探究妊娠糖尿病(GDM)患者血清S100钙结合蛋白A4(S100A4)、Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(FNDC5)水平及其与妊娠结局的关系。方法 选取2020年6月至2022年6月该院126例GDM患者作为GDM组,选取同期孕检的126例健康孕妇作为对照组。根据GDM患者妊娠结局情况分为妊娠结局良好组(76例)和妊娠结局不良组(50例)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清S100A4、FNDC5水平,采用Logistic回归分析GDM孕妇妊娠结局,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清S100A4、FNDC5预测GDM孕妇妊娠不良结局的价值,采用Spearman相关性分析血清S100A4、FNDC5与不良妊娠结局的相关性。结果 GDM组血清S100A4水平明显高于对照组(P<0.05),血清FNDC5水平明显低于对照组(P<0.05)。妊娠结局良好组血清S100A4水平明显低于妊娠结局不良组(P<0.05),血清FNDC5水平明显高于妊娠结局不良组(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,GDM患者血清S100A4水平与不良妊娠结局呈正相关(P<0.05),FNDC5水平与不良妊娠结局呈负相关(P<0.05)。Logistic回归分析表明,血清S100A4、空腹血糖、HOMA-IR是GDM患者发生不良妊娠结局的危险因素(P<0.05),FNDC5是GDM患者发生不良妊娠结局的保护因素(P<0.05)。血清S100A4、FNDC5联合预测GDM妊娠结局的曲线下面积大于S100A4(Z=2.045,P=0.041)及FNDC5单项检测(Z=2.010,P=0.044)。结论 GDM患者血清S100A4水平升高,FNDC5水平降低,二者对评估GDM孕妇妊娠结局具有一定的参考价值。

肺腺癌组织中FNDC1、Napsin A、Smad4表达及临床意义

目的检测肺腺癌中Ⅲ型纤连蛋白结构域1(FNDC1)、天冬氨酸肽酶A(Napsin A)、Smad4的表达及其临床意义。方法回顾性分析2019年12月至2021年12月华中科技大学同济医学院附属协和医院收治的120例肺腺癌患者临床病例资料,收集患者手术切除肿瘤组织和癌旁正常组织。采用免疫组化染色SP法检测肺腺癌组织与癌旁组织中FNDC1、Napsin A、Smad4表达情况,并分析FNDC1、Napsin A、Smad4表达与肺腺癌临床病理特征的关系。随访患者的生存情况,采用Kaplan-meier法绘制生存曲线,生存差异行Log-rank检验;采用Cox风险比例回归模型分析影响肺腺癌患者预后的因素。结果肺腺癌组织中FNDC1阳性表达率为61.67%,高于癌旁组织的20.0%;Napsin A、Smad4阳性表达率分别为41.67%和65.0%,低于癌旁组织的98.33%和90.83%,差异均有统计学意义(P<0.05)。FNDC1、Napsin A、Smad4表达与性别、年龄无关(P>0.05),与TNM分期、病理学分级、肿瘤最大直径、淋巴结转移均有关(P<0.05)。FNDC1阴性表达组患者中位生存时间(OS)为34个月,优于阳性表达组的27个月;Napsin A、Smad4阳性表达组患者中位生存时间分别为30个月和30个月,优于阴性表达组的27个月和25个月;差异均有统计学意义(P<0.05)。单因素Cox风险比例回归模型显示,TNM分期、肿瘤最大直径、淋巴结转移、FNDC1表达、NapsinA表达、Smad4表达是影响肺腺癌OS的因素(P<0.05)。结论肺腺癌组织中FNDC1表达升高,Napsin A、Smad4表达降低,且FNDC1、Napsin A、Smad4表达与临床病理特征、总生存均有关。

FSD1蛋白对胶质瘤干细胞侵袭的影响

目的研究具有SPRY结构域的纤连蛋白Ⅲ型(FSD1)在胶质瘤干细胞侵袭中发挥的作用,探索新的胶质瘤肿瘤标志物或治疗靶点。方法利用TCGA数据库数据,分析比较在多形性成胶质细胞瘤(GBM)组织、正常脑组织及不同分型级别胶质瘤组织中的FSD1的mRNA表达水平,并分析FSD1 mRNA表达水平与胶质瘤患者预后的相关性。利用慢病毒感染体系,在胶质瘤干细胞(GSC)T4121和D456中稳定过表达FSD1蛋白,通过Transwell侵袭实验检测过表达FSD1蛋白对T4121和D456两种GSC侵袭能力的影响。结果 FSD1基因在GBM组织中mRNA表达水平显著低于正常脑组织(P<0.01);FSD1的mRNA表达水平随胶质瘤分型级别提高而降低(Ⅱ级与Ⅲ级比较,P<0.05,Ⅲ级与Ⅳ级比较,P<0.01);FSD1 mRNA低表达的胶质瘤患者的生存期显著低于高表达患者(P<0.01)。在T4121和D456两种GSC细胞系中,过表达FSD1蛋白的GSC侵袭细胞数显著低于空白对照组(2株细胞系中均为P<0.01)。结论 FSD1表达水平是胶质瘤恶性程度的一个临床相关因素,低水平FSD1有利于维持GSC的侵袭能力。

小鼠成肌细胞低氧/复氧模型的建立及验证

目的:构建体外小鼠成肌细胞间歇性低氧/复氧模型并验证。方法:设定三气培养箱的混合气中1%或4%O2含量为低氧培养条件,二氧化碳培养箱中的条件为复氧条件,将小鼠成肌细胞(C2C12)分别按不同氧浓度(1%和4%)及复氧循环周期(6 h和8 h)处理,结束后观察细胞增殖情况,测定细胞培养液中葡萄糖、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)及分泌性蛋白质分子--含Ⅲ型纤连蛋白结构域蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain containing 5, FNDC5)浓度,测定细胞低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)蛋白的表达水平。结果:(1) 1%低氧浓度组较4%低氧浓度组细胞增殖慢、FNDC5含量低,培养液中葡萄糖浓度高、LDH活性及细胞中HIF-1α蛋白表达较高(P<0.05)。(2)1%低氧浓度条件下,与循环周期6 h组相比,循环周期8 h组细胞活力显著下降(P<0.05)。结论:本研究模拟了体外小鼠成肌细胞在不同低氧/复氧条件下的损伤状况及FNDC5的差异表达,1%低氧浓度和复氧循环周期6 h可作为较佳的体外C2C12细胞实验模型建立条件。

夏枯草水提液对甲状腺功能减退大鼠认知功能及PGC-1α/FNDC5/BDNF通路的影响

目的:探究夏枯草水提液(PvWe)对甲状腺功能减退大鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)/Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(FNDC5)/脑源性神经营养因子(BDNF)的调控作用及对认知功能的影响。方法:取SD大鼠72只,用随机数字表法分为正常对照组、模型组、PvWe低(2.5 g·kg^(-1))、中(5.0 g·kg^(-1))、高(10.0 g·kg^(-1))剂量组、阳性对照组(左甲状腺素钠片,9.0μg·kg^(-1)),每组12只;除正常对照组外,其余各组均用切除甲状腺+皮下注射左甲状腺素法建立甲状腺功能减退模型;各组均于造模成功后开始给药6周,qd。末次给药结束后,观察大鼠一般行为;旷场试验及水迷宫试验检测大鼠认知功能;放射免疫法及化学发光免疫分析法检测大鼠血清总甲状腺素(TT4)及促甲状腺激素(TSH)水平变化;碱性羟胺比色法检测前额叶组织乙酰胆碱(Ach)水平;尼氏染色观察前额叶神经元形态变化;Fluoro Jade B染色检测变性神经元数目;免疫荧光共定位法检测PGC-1α与前额叶胆碱能神经元特异性标志物-胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性共表达水平;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测脑前额叶皮层组织PGC-1α、FNDC5、BDNF酪氨酸蛋白激酶B(TrKB)蛋白相对表达水平。结果:与正常对照组相比,模型组大鼠消瘦、萎靡、倦怠行为及神经元丢失、变性等病理损伤严重,逃避潜伏期、血清TSH水平、前额叶组织神经元变性数目升高(P<0.05),跨格次数、直立次数、穿越原平台次数、血清TT4、前额叶组织Ach、PGC-1α^(+)ChAT+、PGC-1α、FNDC5、BDNF、TrKB蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比,PvWe低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠消瘦、萎靡、倦怠行为及神经元丢失、变性等病理损伤缓解,逃避潜伏期、血清TSH水平、前额叶组织神经元变性数目降低(P<0.05),跨格次数、直立次数、穿越原平台次数、血清TT4、前额叶组织Ach、PGC-1α^(+)ChAT+、PGC-1α、FNDC5、BDNF、TrKB蛋白表达升高(P<0.05),其中PvWe剂量越高上述指标变化越明显(P<0.05)。PvWe高剂量组与阳性对照组相比,上述指标变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PvWe可通过提高甲状腺功能减退大鼠甲状腺激素水平,激活PGC-1α/FNDC5/BDNF神经元保护途径,改善大鼠认知功能障碍。

多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1基因的克隆及原核表达

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用Western-blot分析该蛋白的抗原性。结果显示,TmAdh1的基因组序列长1 848bp,由2个内含子和3个外显子组成,其开放阅读框的长度为402bp,编码133个氨基酸残基。预测分析表明,TmAdh1蛋白含有1个N端信号肽序列、1个纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域、1个糖基化位点和8个线性B细胞抗原表位。在原核系统成功表达了约40ku的重组蛋白TmAdh1,用其免疫小鼠制备超免疫血清。Western-blot试验表明,重组蛋白TmAdh1可以与免疫小鼠血清反应。以上研究结果表明,多头带绦虫TmAdh1基因是带科绦虫宿主保护性抗原的同源基因,可作为脑多头蚴病疫苗的候选分子。

血清FNDC5和CTRP12表达水平与代谢相关脂肪性肝病的临床相关性

目的 探究血清Ⅲ型纤连蛋白结构域5(FNDC5)和补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白12(CTRP12)表达水平与代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)患者糖脂代谢、肝功能的相关性。方法 选择2019年6月至2022年6月在洪湖市妇幼保健院和襄阳市中心医院就诊的100例MAFLD患者作为研究对象(设为MAFLD组),另选择同期洪湖市妇幼保健院体检中心的100名健康体检者作为对照组。采用ELISA法检测血清FNDC5和CTRP12表达水平。采用Pearson相关性分析探讨血清FNDC5、CTRP12与MAFLD患者糖脂代谢、肝功能的关系。采用ROC曲线分析血清FNDC5和CTRP12表达水平对MAFLD的诊断价值。采用logistic回归模型分析影响MAFLD发生的危险因素。结果 与对照组相比,MAFLD组的ALT、AST、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TC)、总胆固醇(TG)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均显著升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组相比,MAFLD组的血清FNDC5表达水平显著升高,血清CTRP12表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,MAFLD组的血清FNDC5表达水平与ALT、FBG、TG、FINS和HOMA-IR均呈显著正相关(r=0.504、0.496、0.474、0.418、0.501,P均<0.001);血清CTRP12表达水平与ALT、FBG、TG、FINS和HOMA-IR均呈显著负相关(r=-0.496、-0.421、-0.403、-0.425、-0.496,P均<0.001)。ROC曲线分析结果显示,血清FNDC5和CTRP12联合检测诊断MAFLD的曲线下面积(AUC)为0.860,分别大于单项检测;此外,联合检测的敏感度、特异度分别均分别高于单项检测。多因素logistic回归模型分析结果显示,TG、HOMA-IR和FNDC5均是MAFLD发生的独立危险因素,而CTRP12是MAFLD发生的保护因素(P均<0.05)。结论 MAFLD患者的血清FNDC5表达上调,血清CTRP12表达下调,且均与糖脂代谢、肝功能密切相关,其可能可以成为诊断MAFLD的生物标志物。

利拉鲁肽通过激活CAMKK2/AMPK通路促进骨骼肌FNDC5的表达

目的:探讨利拉鲁肽(LG)对骨骼肌细胞Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDC5)表达水平的影响并探讨其机制。方法:小鼠成肌细胞系C2C12经诱导分化后,给予梯度浓度(1~1 000 nmol/L)LG处理不同时间(0~24 h),观察LG对FNDC5表达及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信号通路活性的影响,以及应用胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体拮抗剂exendin_(9-39)、钙/钙调素依赖的蛋白激酶激酶2(Ca^(2+)/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2,CAMKK2)的抑制剂STO609或AMPK的抑制剂Compound C预处理C2C12肌管细胞,观察FNDC5蛋白表达的改变。AMPK的活性及FNDC5的表达用Western blot法检测。结果:LG能够促进C2C12骨骼肌细胞FNDC5的蛋白表达,并具有剂量及时间依赖性,同时激活AMPK。LG的上述作用可被exendin_(9-39)、STO609或Compound C阻断。结论:利拉鲁肽可促进C2C12小鼠骨骼肌细胞合成FNDC5,此作用依赖于GLP-1受体,可能是通过激活CAMKK2/AMPK信号通路实现的。

构建过表达FNDC5慢病毒载体抑制平滑肌细胞的增殖与迁移

背景:Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain containing 5,FNDC5)属于一种肌肉因子,主要表达于骨骼肌及其他肌肉较多的组织中,可通过结合不同受体影响多种细胞增殖与迁移。目的:构建过表达FNDC5基因的慢病毒载体,获得稳定转染FNDC5的平滑肌细胞系,并观察其对平滑肌细胞增殖与迁移的影响。方法:①体外培养血管平滑肌细胞,经鉴定合格后传代培养。②PCR扩增目的基因FNDC5,将目的基因构建入pLVX-mCMV-ZsGreen-IRESPuro慢病毒载体中,在JM109感受态细胞中进行扩增,测序及鉴定合格后转染293T细胞,包装成过表达慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将获得的重组慢病毒转染平滑肌细胞系,倒置荧光显微镜下观察细胞形态并计算转染效率,嘌呤霉素筛选获得稳转平滑肌细胞株。③将平滑肌细胞分为3组,分别为对照组、空载组和FNDC5过表达组,Real-time PCR和Western blot检测各组平滑肌细胞FNDC5 mRNA及蛋白表达,CCK-8和细胞划痕实验检测各组平滑肌细胞增殖活性及迁移能力。结果与结论:①成功构建FNDC5过表达慢病毒,并得到稳定转染的平滑肌细胞株,平滑肌细胞转染效率为86%;②与对照组、空载组比较,FNDC5过表达组FNDC5 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.001);③与空白组、空载组比较,FNDC5过表达组细胞增殖活性、迁移率明显下降(P<0.05);④结果显示,得到FNDC5稳定转染的平滑肌细胞株,FNDC5过表达可抑制平滑肌细胞增殖与迁移。