中国2011年Ⅲ型脊髓灰质炎病毒基因特征分析

目的研究中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同)2011年急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)病例粪便标本中分离到的Ⅲ型(Type 3)脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus,PV)(PV_Ⅲ)分子生物学特征,为中国维持无脊灰提供实验室依据。方法采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Pogymerase Chain Reaction,RT-PCR)对PV_Ⅲ的衣壳蛋白VP_1编码区基因进行扩增,并对PCR产物进行核苷酸序列测定和分析,对VP_1编码区的核苷酸神经毒力位点和突变热点进行分析,并建立亲缘关系进化树,分析毒株间的进化关系。结果中国2011年从AFP病例粪便标本中,共分离到159株PV_Ⅲ,包括149株疫苗类似株PV和10株免疫缺陷相关的疫苗衍生(Immunodeficiency-associated Vaccine-derived)PV(i_VDPV),未发现Ⅲ型野生型(Wild Type)PV(WPV_Ⅲ)。15株PV_Ⅲ均在VP_1编码区基因已知的神经毒力位点核苷酸2493发生突变。结论突变热点的存在说明PV_Ⅲ的VP_1编码区的核苷酸变异并不是随机分布的,PV_Ⅲ的VP_1编码区基因突变热点可能与PV_Ⅲ的生物学特性有一定的关系。从宁夏回族自治区发现的10株i_VDPVs与以往发现的i_VDPV基因进化上无相关性,证明是新发现的i_VDPV。对VP1编码区的检测为继续维持中国无脊灰状态,为及时发现VDPCs传播和WPV的输入性爆发提供实验室依据。

优化Ⅲ型脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中的增殖条件

型脊髓灰质炎病毒经下游灭活工艺后抗原损失量较大,可以通过优化上游培养工艺来提高病毒产量。为研究病毒接种时间、感染复数(MOI)和病毒收获时间对Ⅲ型脊髓灰质炎病毒感染性滴度(CCID50)和D抗原的影响,优化Ⅲ型脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中的增殖条件,为生产及毒种制备提供指导依据,本研究以接种胞龄和MOI为病毒接种的两个变量条件,以病毒滴度和D抗原含量为病毒收获液中病毒产量的判定指标。先固定MOI,在不同胞龄的Vero细胞上以相同MOI接种Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,根据病毒收获液中病毒产量的结果筛选出产毒量最高的接种胞龄范围。然后以最佳产毒胞龄为固定条件,暨Vero细胞生长至96h^144h,以不同MOI接种病毒,进一步筛选出产毒量最高的MOI范围。结果显示,当MOI=0.003时,Vero细胞培养48h、72h、96h、120h和144h种毒组均在种毒后70h完全病变,Vero细胞培养120h种毒所得收获液D抗原含量和病毒滴度均为最高,分别为(331±31)DU/mL、(8.04±0.14)lgCCID50/mL。接种胞龄固定在96h^144h范围,当MOI为0.001、0.01和0.1时,细胞完全病变时间分别为81h、66h和55h,所得病毒收获液的D抗原含量分别为(301.1±13.8)DU/mL、(303.7±15.6)DU/mL和(272.6±19.6)DU/mL,滴度分别为(7.88±0.13)lgCCID50/mL、(7.58±0.14)lgCCID50/mL和(7.75±0.13)lgCCID50/mL。本研究提示,相同MOI下,不同细胞胞龄种毒后细胞达到完全病变时间相同;细胞培养至平台期前后接种Ⅲ型脊髓灰质炎病毒所获得的收获液D抗原含量和感染性滴度均最高;MOI影响Ⅲ型病毒病变进程,但对病毒产量影响不大;90%以上Vero细胞发生病变、脱落时为最佳收获病毒时间点。

MAPREC与MNVT评价Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒神经毒力的比较

目的用PCR扩增及限制性酶切分析突变技术(MAPREC)和猴体神经毒力试验(MNVT)评价同一批Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力的结果差异。方法采用MAPREC技术,检测Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力关键位点472位点突变率;采用MNVT病理切片分析,评价Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力。结果 MAPREC检测待测样品核酸472位点突变率均值为0.324%,低于高突变参考品的0.621%。MNVT切片结果分析表明,xtest–xref=0.169,小于C1。对同一批样品,MAPREC与MNVT分析结果一致。结论在Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力检测方面,操作简单,试验周期短的MAPREC技术可作为金标准MNVT的有益补充。

脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株C抗原及D抗原生物学特性研究

目的对脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株C抗原和D抗原在形态、感染特性、核酸含量和结构基因核苷酸序列、抗原不同结构蛋白质含量及2种抗原免疫原性等方面的差异进行比较观察,为脊髓灰质炎疫苗的生产评估、检定及进一步在蛋白质翻译后水平研究2种抗原的差异提供依据。方法采用二次氯化铯(CsCl)密度梯度离心的方法分离纯化脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株C、D抗原,对分离的C、D抗原采用微量BCA(bicinchonininc acid)法检测蛋白质浓度,电镜观察病毒形态和纯度,聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)检测病毒不同结构蛋白质组成和含量,逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)定量检测2种抗原单位质量携带核酸含量,并测序比较结构基因核苷酸序列差异;以中高剂量的C、D抗原分别免疫Wistar雌性大鼠,观察2种抗原体内诱生中和抗体的能力。结果脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株单位质量D抗原的病毒滴度高于C抗原约4个对数值;单位质量D抗原的核酸含量高于C抗原近64倍,D抗原和C抗原结构基因核苷酸序列无差异;单位质量D抗原VP1蛋白质含量高于C抗原1.67倍;一次免疫后,D抗原诱导的中和抗体是C抗原的10~50倍。结论脊髓灰质炎Ⅲ型病毒Sabin株D抗原比C抗原具有较强的免疫原性,上述研究结果为脊髓灰质炎疫苗C、D抗原的检测、鉴定及进一步的疫苗效力研究和提高疫苗效力提供了实验依据。

中国口服脊髓灰质炎减毒活疫苗安全性评估

目的研究北京生物制品研究所(北京所)和中国医学科学院医学生物学研究所(昆明所)生产的口服脊髓灰质炎(脊灰)减毒活疫苗(OPV)减毒位点的基因特征,对比Sabin标准株,从基因序列的基础上研究OPV是否安全有效,从而为中国维持无脊灰状态OPV的使用和免疫策略提供科学依据。方法随机选取生产的不同批次OPV,先进行病毒分离和扩增,用中和试验定型,分出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰疫苗病毒,然后用聚合酶链反应(PCR)得到各型脊灰疫苗病毒的5′非编码区(5′NTR区)和VP1蛋白编码区基因核苷酸片段,测序后,与各型脊灰Sabin标准株进行比较分析。结果两个所生产的OPV各型疫苗病毒的5′NTR区核苷酸序列与标准Sabin株各型别5′NTR区无差别,同源性为100%;VP1区核苷酸序列比较,北京所与昆明所OPVⅠ型VP1区与SabinⅠ型VP1区核苷酸序列同源性为100%;北京所OPVⅡ型VP1区与SabinⅡ型VP1区比较,有5个碱基变化,同源性为99.45%,昆明所OPVⅡ型VP1区与SabinⅡ型VP1区比较,有6个碱基变化,同源性为99.34%;北京所与昆明所OPVⅢ型VP1区与SabinⅢ型VP1区比较,都有2个碱基变化,同源性为99.78%。北京所与昆明所生产的OPV,3个型别的5′NTR区和VP1蛋白编码区基因核苷酸序列与标准Sabin株比较,所有神经毒力位点未发生变化,未发生毒力回复突变。结论中国北京所和昆明所生产的OPV是安全有效的,应对如何停止使用OPV,如何用脊灰灭活疫苗取代OPV进行前期研究工作。

山东省临沂市首例疫苗衍生脊髓灰质炎病例流行病学调查与应对

目的探索疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(VDPV)病例管控措施及治疗方法,为应急处置方案的制定提供依据。方法对VDPV病例进行个案调查,采集病例及其父母血液标本进行免疫功能测定和基因检测,并定期采集病例粪便标本分离病毒,对病例所在地和医疗机构开展AFP病例主动搜索,进行儿童脊灰疫苗接种率调查,开展脊灰疫苗查漏补种和应急免疫,对密切接触者和周围健康儿童进行粪便标本带毒率调查和脊灰抗体阳转率检测。结果病例多次进行免疫功能测定,结果显示体内免疫球蛋白含量低于正常值,临床诊断为原发性免疫缺陷综合征,最终分类诊断为免疫缺陷者Ⅲ型疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(iVDPV)病例。共计采集患儿粪便标本108份,其中69份标本检测到脊髓灰质炎病毒,病毒核苷酸最大变异数为37个。丙种球蛋白治疗持续24个月,未能阻断VDPV在肠道内的复制。当地的儿童常规免疫接种率较高,脊灰抗体滴度较高。同时AFP监测系统运转良好,监测灵敏度较高。结论在采取排泄物消毒、脊灰疫苗查漏补种、AFP主动搜索等措施后,该病毒未在当地造成循环。职能部门果断实施突发公共卫生事件Ⅵ级应急响应,开展查漏补种和应急免疫等活动,整个应急处置过程严谨规范,快速有效。当前应保持高水平的脊灰疫苗接种率,保持监测系统高度灵敏性,维持无脊灰状态。同时随着全球消灭脊灰的进展,应适时修订免疫策略。