针刺激活Ⅲ型PI3K/Beclin-1通路调控脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马区细胞自噬

目的:观察针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马组织Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)及Beclin-1等自噬相关指标的影响,探讨针刺调控Ⅲ型PI3K/Beclin-1通路适度激活脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧海马神经细胞自噬的作用机制。方法:SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、针刺组、模型+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、针刺+3-MA组,每组11只。使用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型。模型+3-MA组、针刺+3-MA组于再灌注前30 min予侧脑室注射3-MA 5䥺SymbolmApL(400 nmol/5䥺SymbolmApL)。针刺组、针刺+3-MA组针刺“大椎”“水沟”“百会”,每15 min捻转1次,留针30 min,每12 h治疗1次,共7次。于再灌注后2 h、干预后进行Garcia神经功能评分,干预后通过TTC染色法观察大鼠脑组织缺血面积百分比,Western blot法检测缺血侧海马组织Ⅲ型PI3K、Beclin-1、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、溶酶体相关膜蛋白2(Lamp2)、P62的蛋白表达水平,透射电镜法观察缺血侧海马组织神经细胞超微结构。结果:再灌注后与假手术组比较,其余各组大鼠神经功能评分降低(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分显著降低、脑梗死面积百分比升高(P<0.01),缺血侧海马组织Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Lamp2表达显著降低(P<0.01),P62表达显著升高(P<0.01),神经细胞水肿较重。与模型组比较,干预后针刺组神经功能评分升高、脑梗死面积百分比降低(P<0.01),缺血侧海马组织Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Lamp2表达升高(P<0.01,P<0.05),P62表达降低(P<0.01),神经元结构未见明显损伤,溶酶体增多;模型+3-MA组脑梗死面积百分比升高(P<0.05),Ⅲ型PI3K、Beclin-1表达降低(P<0.01),P62表达水平升高(P<0.05),神经细胞中重度水肿,初级溶酶体存在。与模型+3-MA组比较,针刺+3-MA组神经功能评分显著升高、脑梗死面积百分比显著降低(P<0.05,P<0.01),缺血侧海马组织Ⅲ型PI3K、Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达升高(P<0.01,P<0.05),神经细胞轻度水肿,初级溶酶体存在。与针刺组比较,针刺+3-MA组神经功能评分显著降低、脑梗死面积百分比升高(P<0.05,P<0.01),缺血侧海马组织Ⅲ型PI3K、Beclin-1、Lamp2表达水平降低(P<0.01,P<0.05),P62表达水平升高(P<0.05)。结论:针刺可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损症状,减少脑梗死面积,其机制可能与调控Ⅲ型PI3K/Beclin-1通路,上调海马区自噬相关因子LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Lamp2表达,下调P62表达有关。

治疗性低温通过激活Ⅲ型PI3K通路增加自噬减轻大鼠心肺复苏后的脑损伤

目的探讨Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路调节自噬在低温治疗心肺复苏(CPR)后脑保护机制中的作用。方法取健康雄性SD大鼠作为研究对象,制备窒息致心搏骤停后CPR模型,将自主循环恢复(ROSC)的60只大鼠按随机数字表法分为常温组、低温组及PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预处理组,每组再将大鼠分为ROSC 24h和48h两个亚组,每个亚组10只。常温组控制肛温在(37.0±0.2)℃;低温组在ROSC后立即给予降温处理,目标温度32~34℃。3-MA预处理组于窒息前20min经脑室内注射10mmol/L3-MA5μL;其他组给予等量生理盐水。另取10只大鼠作为假手术(Sham)组,仅麻醉后置管。各组分别于ROSC24h和48h处死大鼠取脑组织,采用干湿重法测定脑组织含水量(BWC),采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)测定脑组织自噬相关蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(LC3)、凋亡相关蛋白Bcl-2和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、Ⅲ型PI3K相关蛋白Vps34和Atg14的表达,透射电镜下观察脑组织超微结构改变。各组于ROSC48h进行神经功能缺损程度评分(NDS)。结果与Sham组比较,常温组大鼠ROSC24h脑皮质即明显水肿,开始出现凋亡和自噬现象,脑组织自噬、凋亡、Ⅲ型PI3K相关蛋白表达均明显升高,并呈一定时间依赖性,ROSC48h神经功能明显损害;低温干预后,大鼠脑水肿明显减轻,未见明显凋亡现象,且自噬现象有所增加,ROSC48h脑组织自噬相关蛋白Vps34、Atg14和Ⅲ型PI3K相关蛋白Beclin-1、LC3表达较常温组进一步升高(Vps34/GAPDH:0.25±0.03比0.15±0.04,Atg14/GAPDH:0.12±0.03比0.05±0.04,Beclin-1/GAPDH:0.060±0.002比0.018±0.002,LC3-Ⅱ/GAPDH:0.160±0.010比0.050±0.010,均P<0.05),凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3表达较常温组明显下降(Bcl-2/GAPDH:0.05±0.03比0.20±0.04,caspase-3/GAPDH:0.050±0.002比0.140±0.015,均P<0.05),神经功能明显改善〔NDS(分):157±85比343±198,P<0.05〕。给予3-MA预处理可抑制低温干预对脑组织的保护作用,大鼠ROSC48h脑组织Vps34、Atg14、Beclin-1、LC3蛋白表达较低温组明显降低(Vps34/GAPDH:0.18±0.03比0.25±0.03,Atg14/GAPDH:0.07±0.04比0.12±0.03,Beclin-1/GAPDH:0.015±0.003比0.060±0.002,LC3-Ⅱ/GAPDH:0.045±0.030比0.160±0.010,均P<0.05),Bcl-2、caspase-3的蛋白表达较低温组明显升高(Bcl-2/GAPDH:0.15±0.04比0.05±0.03,caspase-3/GAPDH:0.120±0.015比0.050±0.002,均P<0.05),NDS评分较低温组明显升高(分:341±208比157±85,P<0.05)。结论低温干预可减轻CPR后脑水肿,改善脑功能,其机制可能与激活Ⅲ型PI3K通路,增加自噬、抑制凋亡有关。

白藜芦醇对胃癌SGC7901细胞自噬的影响及其机制探讨

目的观察白藜芦醇(RES)对胃癌SGC7901细胞自噬的影响,探讨Ⅲ型PI3K激酶在其中的作用。方法不同浓度(0、10、20、50、75、100μmol/L)RES作用SGC7901细胞24 h,或Ⅲ型PI3K特异性抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)、渥曼青霉素(WM)及自噬晚期抑制剂氯喹(CQ)预处理细胞1 h后加入不同浓度RES再作用24 h;采用Western blot法观察自噬特异性蛋白LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转化的情况,甲丹磺酰尸胺染色(MDC)观察自噬囊泡。结果不同浓度RES均可引起LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,且随浓度增加转化越明显;CQ预处理1 h后RES继续处理24 h,细胞内LC3蛋白转化、自噬酸性囊泡进一步增加;Ⅲ型PI3K特异性抑制剂3-MA(WM)不改变RES引起的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,不抑制MDC阳性细胞增加、细胞内酸性囊泡的聚集。结论 RES可增强胃癌SGC7901细胞内自噬水平,而非自噬降解功能削弱导致,该作用不依赖于Ⅲ型PI3K。

中医药调控细胞自噬防治消化系统疾病研究现状

消化系统疾病是临床中常见病、多发病,临床表现纷繁复杂,疾病之间相互关联,严重影响患者生命质量。细胞自噬是维护胃黏膜细胞稳态的重要因素,是导致消化系统疾病发病的重要环节。中医药作为临床防治消化系统疾病的重要干预措施之一,其防治作用及机制成为近年来研究的重要方向。本文通过收集相关文献资料,重点从ULK1蛋白激酶复合体、Vps34-Beclin1和Ⅲ型PI3K复合体、mAtg9、Atg5-Atg12-Atg16连接系统和LC3连接系统中具体信号通路及相关蛋白分析近年来中医药对消化系统疾病细胞自噬的调控的研究现状,以期发现中医药调节自噬对于细胞保护的作用,从而对于中医药防治消化系统疾病提供依据。