皮肤石蜡组织Ⅳ型胶原免疫荧光抗原修复方法的评估

目的 寻找皮肤石蜡包埋组织Ⅳ型胶原免疫荧光(IF-PE)最佳抗原修复方法。方法以2021年1月至2022年12月在上海交通大学医学院附属儿童医院确诊的X-连锁Alport综合征患儿和父(母)亲共14例皮肤组织,冰冻组织免疫荧光(IF-FT)为自身对照,比较不同抗原修复法IF-PE染色部位和强度。结果 与Ⅳ型胶原IF-FT自身对照比较,采用蛋白酶K修复,仅部分患儿基膜正常分布(6/14),而角质层均异常表达;微波、高温水浴和高压蒸汽3种修复方法,基膜均无正常分布,角质层异常分布(分别为2/14,11/14,12/14);微波联合酶修复法仅2例基膜正常分布,未见角质层异常表达;高压蒸汽联合酶和高温水浴联合酶2种修复法基膜全部正常分布,角质层异常表达(分别为14/14和2/14),表达强度两者接近。结论高温水浴联合蛋白酶K可作为皮肤石蜡包埋组织Ⅳ型胶原免疫荧光理想的抗原修复法。

血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽和Ⅳ型胶原辅助诊断原发性肝癌的临床意义分析

目的 分析血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)和Ⅳ型胶原(CⅣ)辅助诊断原发性肝癌的可行性和临床价值。方法 选取82例原发性肝癌患者、33例肝硬化患者及127例健康对照者作为研究对象,分别作为原发性肝癌组、肝硬化组及健康对照组。检测并比较三组血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平;分析血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ的受试者工作特征曲线(ROC曲线)及曲线下面积(AUC);分析血清HA、LN、PⅢNP和CⅣ的诊断界值及诊断效能。结果 原发性肝癌组血清HA 80.32(42.18, 165.50)ng/ml、LN 42.91(31.47, 74.91)ng/ml、PⅢNP 16.15(10.93, 31.33)ng/ml和CⅣ126.00(73.16, 236.60)ng/ml均显著高于健康对照组的26.83(17.25, 40.02)、30.46(25.02, 40.95)、6.38(4.93, 7.86)、48.49(40.24, 57.57)ng/ml(P<0.05);原发性肝癌组血清HA、LN、PⅢNP水平显著低于肝硬化组(P<0.05),原发性肝癌组血清CⅣ水平与肝硬化组比较无统计学差异(P>0.05);肝硬化组血清HA、LN、PⅢNP和CⅣ水平均显著高于健康对照组(P<0.05)。ROC曲线及AUC分析血清HA、LN、PⅢNP和CⅣ的诊断效能显示:血清HA、LN、PⅢNP和CⅣ诊断原发性肝癌的AUC分别为0.8453、0.7195、0.9310和0.8842;血清HA、LN和PⅢNP鉴别原发性肝癌和肝硬化的AUC分别为0.7749、0.6208和0.6384。根据ROC曲线计算原发性肝癌和肝硬化的诊断界值,血清HA+LN+PⅢNP+CⅣ诊断原发性肝癌的灵敏度为92.7%。结论 血清HA、LN、PⅢNP和CⅣ可用于原发性肝癌的辅助诊断,具有重要的临床价值。

Ⅳ型胶原蛋白A4在肾透明细胞癌中的表达及其与预后和免疫浸润的相关性分析

目的探究Ⅳ型胶原蛋白A4(collagen typeⅣalpha 4 chain,COL4A4)在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中的表达及其与临床预后和免疫浸润的关系。方法利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析COL4A4在ccRCC组织和癌旁正常组织中的表达差异。Western blot实验探究COL4A4在人ccRCC细胞株(786-O、OS-RC-2、Caki-1、SW839和RCC4)和人正常肾小管上皮细胞株HK-2中的表达差异。Kaplan-Meier曲线用于分析COL4A4表达与ccRCC患者的临床总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期的关系,并用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价COL4A4对预测ccRCC发生的诊断价值。利用cBioPortal和COSMIC数据库分析COL4A4在ccRCC中的突变情况。采用STRING数据库构建COL4A4的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络。采用LinkedOmics数据库构建COL4A4的共表达基因网络。采用R软件进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析。基于TCGA数据的单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)分析ccRCC中COL4A4表达与免疫浸润的相关性。结果TCGA和GEO数据库均显示,COL4A4在ccRCC组织中低表达(均P<0.05)。Western blot实验证实,COL4A4在ccRCC细胞株(786-O、OS-RC-2、Caki-1、SW839和RCC4)中均低表达(均P<0.05)。高表达COL4A4的患者具有更好的总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期(均P<0.01)。COL4A4是ccRCC患者的独立危险因素(HR=0.562,95%CI:0.352~0.898,P<0.05)。COSMIC数据库发现,COL4A4突变频率较低,在ccRCC中稳定表达。PPI网络显示,COL4A4与整合素家族密切相关。功能富集分析发现,COL4A4参与GTP酶活性调节、细胞核分裂、细胞周期转换、自噬和T细胞激活等生物学过程。信号通路富集分析提示,COL4A4主要参与沙门氏菌感染和细胞间的紧密连接。免疫浸润分析发现,COL4A4表达与调节性T细胞浸润呈负相关(r=-0.428,P<0.05)。结论COL4A4是ccRCC的潜在生物预后标志物和治疗靶点。

肾组织石蜡切片Ⅳ型胶原α链免疫组织化学染色在诊断Alport综合征中的应用

目的对Alport综合征(AS)患者肾脏穿刺组织进行石蜡切片Ⅳ型胶原α链免疫组织化学检测,探讨其临床应用价值。方法选取2018年11月至2022年7月浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心确诊的10例AS患者(AS病例组)、10例心脏死亡器官捐献者(DCD)供肾及10例确诊为免疫球蛋白A肾病患者(对照组)的肾组织进行石蜡切片Ⅳ型胶原α1、α3、α5链全自动免疫组织化学染色,将其与冰冻切片免疫荧光染色结果进行比较。将对照组肾组织石蜡切片分别采用多种方法进行抗原修复,比较修复效果。结果对照组肾组织2种染色方法Ⅳ型胶原α1、α3、α5链染色在肾小球基底膜(GBM)中均为连续线状阳性表达。AS病例组肾组织2种染色方法Ⅳ型胶原α1链染色在GBM均呈连续线状阳性表达,α3、α5链染色在GBM为阴性或节段弱阳性表达。2种染色方法染色结果具有较高的一致性(Kappa=0.615,P=0.035)。结论石蜡切片全自动免疫组织化学检测Ⅳ型胶原α1、α3和α5能较好地用于AS的诊断,为AS的诊断和研究提供了一种可靠的技术手段。

血清Ⅳ型胶原、透明质酸及板层素对肝纤维化的诊断价值

本文用放射免疫法检测了２２０例各型肝病患者血清Ⅳ型胶原（Ⅳ－Ｃ）、透明质酸（ＨＡ）及板层素（ＬＮ）水平。结果显示各类肝病患者血清Ⅳ－Ｃ、ＨＡ及ＬＮ水平随病情进展而逐渐升高，以Ⅳ－Ｃ≥１３０μｇ／Ｌ、ＨＡ≥２６０μｇ／Ｌ、ＬＮ≥１６０μｇ／Ｌ为诊断肝纤维化的临界点，其敏感度、特异性、准确率分别达８０％以上，联合检测以Ⅳ－Ｃ与ＨＡ联合较为理想，说明三者可作为肝纤维化诊断较为敏感的指标，其中Ⅳ－Ｃ对早期肝纤维化的诊断优于ＨＡ和ＬＮ。

Ⅳ型胶原糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响

目的研究糖尿病患者皮肤组织中Ⅳ型胶原的糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响。方法体外培养表皮干细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光化学方法鉴定其标志物(角蛋白19和β1整合素),将表皮干细胞分别接种在包被有正常Ⅳ型胶原和糖基化Ⅳ型胶原的培养板上,比较两者黏附率、生长曲线和克隆生成率。结果糖基化Ⅳ型胶原上生长的表皮干细胞的黏附率和克隆生成率均较正常胶原组低(P<0.05)。结论Ⅳ型胶原的糖基化抑制了表皮干细胞的黏附与增殖,可能是糖尿病患者创面难愈的机制之一。

Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景：发育生物学研究表明，表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉，如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞，并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。目的：观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况，并与角质细胞进行对照。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008—01／06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本，由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品，角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。方法：将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100mg／L，均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本，剪成3．0mm×5．0mm皮条片，4℃胰蛋白酶＋EDTA联合消化8～10h，表皮真皮分离，用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打，获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板，置37℃、体积分数为0．05的CO2饱和湿度培养箱中，20min后吸去培养液和未黏附细胞，加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10μg／L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液，细胞约70％-80％融合后传代扩增；将未黏附细胞接种于另一培养板中，相同条件下作为角质细胞对照培养。主要观察指标：表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。结果：经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形，折光性较强；1d后细胞略伸展为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形核；3d时出现表皮干细胞克隆；5d时克隆数量明显增多，细胞之间紧密衔接，呈铺路石状；14d左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率（t=1．972，P〈0．05）。结论：采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞，且呈明显克隆性生长，具有典型的干细胞生物学特性。

糖尿病肾病Ⅳ型胶原水平变化的临床意义及葛根素的治疗作用

目的 探讨糖尿病肾病 型胶原水平的变化及给予葛根素治疗后的变化。方法 测定血清 型胶原与病程、糖基化血红蛋白、年龄、体质量指数的相关性 ;观察用葛根素前后的尿白蛋白、 型胶原及血液流变学变化。结果 糖尿病患者 型胶原水平明显升高 (P<0 .0 5 ) ,早期糖尿病肾病组较正常白蛋白尿组 型胶原水平明显升高 (P<0 .0 5 )。用葛根素治疗前后尿白蛋白降低。结论 葛根素对早期糖尿病肾病有治疗作用 ,其机制可能与抑制非酶糖基化反应及降低血液粘稠度有关。

不同的抗原修复方法在Ⅳ型胶原免疫组化染色中的应用

Ⅳ型胶原（collagenIV）是构成基膜致密层的主要成分，亦属于纤维型胶原。在基膜中呈三维的网状结构，与其他成分如层黏连蛋白、纤维连接蛋白等共同组成细胞外基质。

尿Ⅳ型胶原检测对早期糖尿病肾病临床诊断意义的研究

目的 :研究尿Ⅳ型胶原在糖尿病肾病 (DN)早期肾损害时的变化及与其他相关指标之间的关系。方法 :采用一步夹心酶联免疫吸附法对 85例糖尿病患者及 2 4例正常成人尿Ⅳ型胶原水平进行检测。结果 :正常白蛋白尿组尿Ⅳ型胶原水平明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ;微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组尿Ⅳ型胶原水平明显高于正常白蛋白尿组 (P均 <0 0 1) ;尿Ⅳ型胶原水平与尿白蛋白及病程之间存在显著的正相关 ,尿Ⅳ型胶原水平与血糖、体重指数、血脂及血压之间无相关性。结论 :DN存在着胶原代谢的异常。尿Ⅳ型胶原在DN肾损害早期明显增高 ,并随病情进展持续性增高 。

益气活血法对脑出血大鼠脑组织Ⅳ型胶原表达的影响

目的探讨益气活血中药对脑出血大鼠脑损伤区组织Ⅳ型胶原表达的影响及其作用机制。方法 150只SD大鼠被随机分为假手术组、模型组、益气活血组、益气组和活血组各30只。用Ⅶ型胶原酶诱导脑出血大鼠模型。各组相应灌服蒸馏水、益气活血法代表方补阳还五汤全方及其益气组分、活血组分药物。用免疫组化方法检测术后3、71、42、1 d和28 dⅣ型胶原的表达,其结果进行平均光密度扫描半定量分析。结果假手术组不同时间点Ⅳ型胶原表达未见明显阳性信号;模型组、益气组、活血组及益气活血组脑出血后3 d即有Ⅳ型胶原表达,模型组及益气组至21 d达到高峰,随后开始下降;活血组及益气活血组表达高峰时间提前至14 d,并至21 d时仍维持一定的表达水平;各个时间点益气活血组表达均高于其他组。结论益气活血中药可能通过增强脑出血后血肿周围脑组织Ⅳ型胶原的表达参与组织修复。

黄芪注射液对糖尿病肾病患者血转化生长因子-β_1及Ⅳ型胶原水平的影响及其意义

目的:通过检测黄芪注射液治疗前后糖尿病肾病患者血清TGF-β1、Ⅳ型胶原水平的变化,探讨其与糖尿病肾脏病变之间的关系,以及黄芪治疗糖尿病肾病的机制。方法:62例糖尿病患者,根据尿白蛋白排泄率分为糖尿病无肾病组28例,糖尿病肾病组34例。糖尿病肾病组接受黄芪注射液治疗。另设25例健康者作为对照组。结果:糖尿病患者血清TGF-β1、Ⅳ型胶原水平较对照组明显升高,糖尿病肾病组较无肾病组也明显升高。使用黄芪治疗后,糖尿病肾病组血中TGF-β1、Ⅳ型胶原水平逐渐降低,尿中白蛋白含量减少。结论:TGF-β1和Ⅳ型胶原在糖尿病肾病的发病过程中起重要作用,黄芪治疗糖尿病肾病的机制可能是通过抑制TGF-β1的表达实现的。

淫羊藿苷改善糖尿病大鼠睾丸病变及其对转化生长因子β_1和Ⅳ型胶原蛋白酶表达的影响

目的:研究淫羊藿苷对糖尿病大鼠睾丸病变的改善,并初步讨论其可能的作用机制。方法:采用链脲佐菌素(40 mg.kg-1)尾静脉注射建立糖尿病大鼠模型。实验分为3组:正常组、模型组和淫羊藿苷组。淫羊藿苷组给予淫羊藿苷溶液80 mg.kg-1.d-1灌胃。12周末处死各组大鼠,测血清葡萄糖和睾酮含量,睾丸组织中特异性酶琥珀酸脱氢酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)及乳酸脱氢酶(LDH)活性;HE染色,置光镜下观察睾丸组织病理变化;免疫组化法测定转化生长因子β1(TGF-β1)和Ⅳ型胶原蛋白酶的表达。结果:与正常对照组比较,模型组血清葡萄糖水平上升和睾酮水平下降;睾丸组织特异性酶活性降低;病理学检测可见生精上皮层变薄,各级生精细胞减少;TGF-β1和Ⅳ型胶原蛋白酶表达增加。淫羊藿苷组明显改善上述指标(P<0.01)。结论:淫羊藿苷对糖尿病所致的睾丸损伤有明显的保护作用,其机制可能与促进睾酮释放、抑制睾丸Ⅳ型胶原蛋白酶及TGF-β1表达有关。

黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠血清LN和Ⅳ型胶原含量影响

目的:观察黄芪卫矛合剂对实验性糖尿病肾病大鼠血清Ⅳ型胶原和LN含量的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分4组,假手术组、模型组、中药组和西药组,后3组选用左肾摘除及尾静脉注射链脲佐菌素方法造成糖尿病肾病大鼠模型。中药组应用黄芪卫矛合剂灌胃,西药组予氯沙坦灌胃,假手术组和模型组予等量纯净水灌胃,共进行12周。实验结束,检测各组大鼠血清LN和Ⅳ型胶原含量。结果:黄芪卫矛合剂组可降低大鼠血清Ⅳ型胶原,且优于西药对照组,两组均能降低LN含量,无显著差异。结论:黄芪卫矛合剂能减少肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原是其防治DN的作用机制之一。

复方黄连胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β_1与Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

目的:探讨复方黄连胶囊(CRCC)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾病变的保护作用及其机制。方法:以链脲佐菌素(STZ)复制早期DN大鼠模型,动物分为正常组、模型组、CRCC高、中、低剂量组(生药含量分别为4.36,2.18,1.09 g.kg-1)、消渴丸(XKW)0.80 g.kg-1治疗组,灌胃给药,每天1次,30 d后检测空腹血糖(FBG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、胰岛素(Ins)及尿蛋白(Upro);光镜观察肾组织形态学改变;免疫组织化学检测肾小球系膜细胞转化生长因子β1(TGF-β1)与Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)蛋白的表达。结果:CRCC可降低大鼠FBG,BUN,Cr及Upro水平,升高Ins,降低肾小球系膜细胞TGF-β1与Ⅳ-C蛋白的表达,改善肾组织形态学异常。结论:CRCC对早期DN大鼠肾微循环病变具有保护作用,延缓DN慢性病理进展,这种作用可能与其抑制肾组织TGF-β1与Ⅳ-C蛋白表达有关。

MMP-9和TIMP-1在高氧致CLD新生大鼠肺组织的动态变化及其对Ⅳ型胶原的影响(英文)

目的探讨MMP-9(基质金属蛋白酶-9)和TIMP-1(基质金属蛋白酶抑制物-1)在高氧致CLD新生大鼠肺组织中的动态变化和在Ⅳ型胶原重塑中的作用。方法足月新生大鼠在生后12h内分别持续吸入浓度为0.90～0.95的高氧和空气,于1,3,7,14和21d,应用免疫组化的方法分别检测肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白表达的动态变化,同时采用ELISA法动态检测肺组织中Ⅳ型胶原蛋白含量。结果MMP-9在高氧3d时的表达较空气组增强,蛋白平均灰度值为:(126.23±6.95)vs(130.38±7.36),P<0.05,其余时间点两组比较差异无显著性;TIMP-1在3d后高氧组肺组织的表达均高于空气组,3d和7d时平均灰度值为:(126.22±6.49)vs(129.49±4.75),(119.70±7.33)vs(124.99±6.83)(P<0.05),14d和21d差异有显著性,值为(112.35±10.29)vs(120.08±7.77),(109.19±10.56)vs(118.22±6.32)(P<0.01);高氧组ColⅣ含量在14d[(24.78±5.42)vs(14.90±2.44),P<0.05]和21d[(40.27±1.94)vs(26.13±1.94),P<0.01]均高于空气组。结论新生大鼠随着吸入高氧时间的延长,MMP-9/TIMP-1的平衡状态遭到破坏,Ⅳ型胶原降解失衡,促进了早期基膜损伤的加重和晚期伴有Ⅳ型胶原沉积的肺纤维化。