微小RNA-203对Ⅳ型胶原蛋白α4链基因的靶向调控及其在口腔黏膜下纤维化中的作用

目的 构建微小RNA-203（microRNA-203,miR-203）表达质粒和Ⅳ型胶原蛋白α4链（collagen typeⅣalpha 4,COL4A4） 3＇UTR荧光素酶报告基因,探究miR-203对COL4A4的靶向调控作用及其在口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis,OSF）中的作用.方法 通过生物信息学软件对miR-203可能调控的靶基因进行预测,结合其生物学功能,筛选出miR-203可能的靶基因COL4A4.收集2016年1至4月在中南大学湘雅口腔医院黏膜科就诊、具有典型病理特征、未经治疗、不伴其他口腔疾病的9例OSF患者颊黏膜组织（OSF组）及其配对的正常组织（对照组）,应用蛋白质印迹法检测两组标本中COL4A4的表达,实时定量聚合酶链反应法检测miR-203的相对表达量.通过生物信息学软件（http：//www.targetscan.org/）寻找COL4A4基因3UTR与miR-203之间的作用位点.将COL4A4基因3 UTR包括miR-203结合位点、上下游部分侧翼序列以及酶切位点在内共60 bp片段分别克隆入哺乳动物细胞miRNA表达报告载体（pMIR-REPORT Luciferase）荧光素酶报告基因载体,将其分别与β-半乳糖苷酶表达质粒及miR-203表达载体共转染293T细胞,24 h后检测报告基因活性.结果 COL4A4的相对表达水平OSF组（2.46±2.26）显著高于对照组（0.70±0.49）（P＜0.05）;miR-203的相对表达水平（2-△△CT） OSF组（2.57±2.09）显著低于对照组（154.07±191.11）（P＜0.01）.生物信息预测显示,COL4A4基因3＇UTR与miR-203之间有一物种间保守作用位点（位点1）,3个非保守作用位点（位点2,3,4）;miR-203能明显抑制位点1介导的报告基因活性,能部分抑制位点2与位点4介导的报告基因活性,而对位点3介导的报告基因活性无显著影响.结论 在OSF组织中,miR-203与COL4A4的蛋白表达呈负相关,miR-203靶向结合COL4A4基因3＇UTR,抑制COL4A4蛋白表达.