西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛相关基因的功能研究

通过在NCBI上对西瓜噬酸菌(AC001)全基因组的比对,发现目前所知的Ⅳ型菌毛相关基因由18个基因组成,通过构建Ⅳ型菌毛部分基因的突变体,然后通过浸种试验进行致病力测定。结果发现,在突变的9个基因中,Aave_3550(PilE)、Aave_3156(PilZ)和Aave_4679(PilA)基因的突变对致病力影响明显。对致病力相关突变体进行相关功能分析发现,这些突变体的生长速度没有受到影响,而生物膜形成能力及游动能力明显下降,致病力减弱。构建互补菌株可使其功能部分恢复。上述结果证明:西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛与致病性相关,并明确了部分基因对致病性有影响。

侧柏叶颗粒剂对产气荚膜梭菌Ⅳ型菌毛系统功能的抑制作用及其机制

为研究侧柏叶颗粒剂(Platycladi cacumen granules,PCG)对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)Ⅳ型菌毛系统(typeⅣpili,TFP)功能的抑制作用及其机制,首先,在体外进行滑动运动和生物被膜测定2种表型试验,验证PCG对TFP功能的抑制作用;随后,通过细胞黏附试验测定PCG对产气荚膜梭菌黏附至人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)的影响;最后,通过qRT-PCR测定PCG对TFP基因转录的影响,并结合透射电镜(TEM)观察PCG对TFP形态的影响。结果显示,PCG在质量浓度为1.3 g/L时,显著抑制产气荚膜梭菌的滑动运动和生物被膜形成;显著抑制产气荚膜梭菌黏附至Caco-2细胞,在有效浓度范围内对Caco-2细胞无明显检测毒性;qRT-PCR和TEM结果表明,PCG通过降低产气荚膜梭菌的TFP相关基因virR、virS、pilA、pilD、pilT、pilC和pilM的转录水平,破坏TFP菌毛形态,抑制TFP介导的功能。

Ⅳ型菌毛可视化方法及其在菌毛功能研究中的应用

Ⅳ型菌毛(type Ⅳ pili,TFP)作为细菌表面的重要蛋白结构,是细菌的感知器官及运动器官,在细菌生理学、细胞黏附、宿主细胞入侵、DNA摄取、蛋白质分泌、生物被膜形成、细胞运动和电子传递等方面发挥着多种作用。近年来,随着研究方法的深入和技术设备的发展,尤其是随着多种菌毛可视化工具的开发,越来越多的研究揭示了它在生命活动中的各种功能,大大加快了微生物单细胞领域的研究步伐。本文重点讨论了TFP可视化方法及在菌毛功能研究中的应用,为更好地研究和利用TFP功能提供更多的思路,为其未来在生物学、医学以及生态学中的应用提供一定的理论基础。

嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的扩增编码Ⅳ型菌毛蛋白的嗜肺军团菌pilE基因,构建重组质粒pET32a(+)-pilE并在原核系统中表达,纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE,为进一步探讨Ⅳ型菌毛蛋白的作用及其作为军团病的诊断抗原提供实验基础。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从嗜肺军团菌扩增得到pilE基因,构建重组质粒pET32a(+)-pilE,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用聚合酶链式反应、限制性酶切分析、序列分析鉴定后,IPTG诱导表达PILE蛋白,用硫酸十二烷酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹鉴定。使用HisTrapTMHP亲和层析柱纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。结果扩增出430bp的pilE基因;构建了重组质粒pET32a(+)-pilE;表达并纯化出35700Mr的目标蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的原核重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。成功纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。

革兰阴性细菌Ⅳ型菌毛的致病机制研究进展

革兰阴性杆菌是临床上能引起严重感染的重要菌群，其毒力因子之-Ⅳ型菌毛的作用正越来越受到关注。Ⅳ型菌毛分布于革兰阴性细菌的表面，由多基因编码各种结构性和功能性菌毛蛋白，在革兰阴性细菌的致病过程中发挥作用。Ⅳ型菌毛有重要的黏附功能，介导细菌和宿主上皮细胞的识别、接触；而且其特有的表面运动、帮助细菌生物膜的形成及转化、噬菌转导和免疫调节等作用均构成了其独特且重要的毒力作用。

新发现的伤寒杆菌ⅣB型菌毛致病性研究

目的 :研究伤寒杆菌菌株ⅣB型菌毛的致病特性。方法 :本研究将表达ⅣB型菌毛的的伤寒杆菌J341及另一插有强启动子Tac并表达ⅣB型菌毛的重组伤寒杆菌菌株TyphiA2 1 6和不表达ⅣB型菌毛的伤寒杆菌菌株TyphipilS∶∶kmr 分别攻击人的THP 1细胞和小鼠腹腔巨噬细胞 (MΦ) ,利用细胞毒检测试剂盒检测细胞受到伤寒杆菌攻击后 ,伤寒杆菌对细胞的毒性作用 ;同时进一步采用实时荧光定量PCR法检测伤寒杆菌毒力岛上的ⅣB菌毛对人单核细胞的侵袭作用 ,分析表达ⅣB菌毛的伤寒杆菌菌株J341及TyphiA2 1 6和不表达ⅣB型菌毛的伤寒杆菌菌株TyphipilS∶∶kmr 分别对THP 1细胞的侵袭作用 ,通过对细胞内侵入的伤寒杆菌的ⅣB菌毛基因 (pilS)和伤寒杆菌O抗原的聚合酶基因 (rfc)DNA的含量的检测 ,来比较进入胞内细菌含量的差别。结果 :比较发现J341及TyphiA2 1 6比TyphipilS∶∶kmr 对人的细胞有更强的毒性以及侵袭性 ,而对鼠的细胞毒性和侵袭性没有明显差异。结论 :说明伤寒杆菌ⅣB型菌毛与细菌侵入人体细胞的毒性和侵袭性密切相关 ;并且伤寒杆菌ⅣB型菌毛的侵袭性和细胞毒性具有种属特异性 ,即对人的单核细胞等细胞有致病性 ,而对鼠的巨噬细胞无致病性。

伤寒杆菌ⅣB型菌毛诱导THP-1细胞IL-6表达的机制探讨

目的探讨伤寒杆菌ⅣB型菌毛诱导THP-1细胞IL-6表达的机制。方法将THP-1细胞或人外周血单个核细胞PBMC分别与有ⅣB型菌毛的A21-6菌、缺失ⅣB型菌毛的pilS-菌共同孵育,ELISA法检测IL-6水平,荧光素酶报道基因分析法检测核转录因子(NF)-κB活化水平;用蛋白激酶C(PKC)活化抑制剂DECA预处THP-1细胞,然后以A21-6菌诱导,测定NF-κB活化水平和IL-6水平。结果 THP-1细胞或PBMC经有ⅣB型菌毛的A21-6菌诱导后,IL-6的产生水平以及NF-κB活化水平均显著高于相应对照组。PKC活化抑制剂DECA一定程度上能够抑制ⅣB型菌毛诱导的THP-1细胞NF-κB活化水平和IL-6水平。结论ⅣB型菌毛作为细菌一种重要致病因素,经由PKC-NF-κB通路促进THP-1细胞的IL-6表达。

大肠杆菌O157∶H7菌毛hcpA基因产物的小鼠免疫保护试验(英文)

最近鉴定的大肠杆菌O157∶H7Ⅳ型菌毛(HCP)与细菌粘附、定植和致病有着密切关系。本文研究表明,PCR扩增出15个大肠杆菌O157∶H7分离株HcpA基因,透射电镜观察到HCP表达于菌体表面。同时,构建BL21(pET32-hc-pA)重组菌,成功表达重组蛋白His-HcpA。His-HcpA免疫家兔制备高滴度(1∶12800)多克隆抗体,Western blot显示能够与HCP菌毛蛋白反应。Balb/c小鼠分别在0周和第3周皮下接种His-HcpA,和对照组小鼠相比,获得70%存活率,并且排菌量降低,排菌时间缩短。本研究表明,His-HcpA具有良好的免疫原性,是大肠杆菌O157∶H7重要的毒力因子。

铜绿假单胞菌菌毛蛋白诱导IL-1β产生的研究现状

铜绿假单胞菌(Pa)侵染人体成功后,能引起炎性反应。然而,菌体细胞表面的Ⅳ型菌毛(TFP)是致炎因子之一。菌毛的主要组成成分是PilA蛋白,一个菌毛由几千个PilA蛋白亚单位组成。PilA蛋白能够诱导宿主巨噬细胞产生IL-1β,IL-1β是宿主防御的关键炎性细胞因子,能够介导多种炎性反应,包括T细胞极化、抗体产生、发热及内皮和吞噬细胞的激活。本文综述了铜绿假单胞菌菌毛蛋白诱导IL-1β产生的研究现状。

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1--pilE。经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物。将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性。结果扩增出了429bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白。pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1(+)组(P<0.01)。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。

山苍子油对产气荚膜梭菌感染肉鸡坏死性肠炎的防治作用及机制

通过滑动运动试验、透射电镜观察和生物被膜抑制试验等分析山苍子油抑制产气荚膜梭菌Ⅳ型菌毛系统(typeⅣpilus system,TFP)功能的作用;建立产气荚膜梭菌感染肉鸡坏死性肠炎模型,测定各组肉鸡体质量变化、小肠炎性反应、细菌载量和组织病理学变化以探究山苍子油对肉鸡坏死性肠炎的防治作用。结果显示,16mg/L山苍子油不影响细菌生长,但可显著抑制产气荚膜梭菌Ⅳ型菌毛介导的滑动运动和生物被膜形成(P<0.05);与产气荚膜梭菌感染肉鸡相比,山苍子油处理能够有效缓解肉鸡的小肠病变,肠道细菌载量降低1.3个log10(P<0.05),降低肉鸡料肉比(P<0.05),提高饲料转化率;山苍子油通过调控紧密连接蛋白的表达促进产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道屏障功能的修复,显著抑制肠道炎性因子水平(P<0.05),进而促进肠道健康。结果表明,山苍子油能够抑制产气荚膜梭菌TFP生物学功能,修复感染肉鸡肠道屏障,发挥抗产气荚膜梭菌感染作用,为肉鸡坏死性肠炎感染防控提供新型策略。

质粒介导重排子的发现、结构和功能

细菌耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题。接合转移是耐药质粒快速传播的重要方式,其中Ⅳ型菌毛在此过程中发挥着重要的作用。Ⅳ型菌毛具有黏附作用,能够使细菌黏附在宿主细胞和其他介质表面,帮助细菌形成生物被膜、细菌聚集体和微菌落,是细菌在液体中接合转移的重要因素。PilV蛋白是R64质粒Ⅳ型菌毛尖端黏附素,可以识别细菌细胞膜上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。重排子(shufflon)结构是多重DNA倒位系统,可使PilV蛋白多样化,进而影响细菌液体接合转移过程中的受体菌识别和接合转移频率。重排子结构最先发现存在于IncI1质粒R64,后陆续在IncI2、IncK、IncZ质粒以及伤寒沙门氏菌致病岛中被发现,其主要由A、B、C、D这4个片段及特异性重组位点sfx组成,受其下游重组酶基因rci的调控,不同质粒的重排子结构存在一定的差异。近期备受关注的可转移多黏菌素耐药基因mcr-1主要位于IncI2型质粒上,重排子可能是其快速传播的原因之一。本文综述了质粒介导重排子的发现、结构、功能和流行,期望基于对重排子更全面深入地了解,能够为耐药质粒的传播机制和控制策略研究提供理论基础。

肠产毒性大肠埃希菌定植因子研究进展

肠产毒性大肠埃希菌定植因子为近几年发现的一种重要的细菌致病菌毛,它能使大肠杆菌粘附于宿主肠牯膜而不被肠蠕动和肠分泌液所清除,再通过其分泌肠毒素导致婴幼儿和旅行者腹泻。菌毛亚单位的保守区域、抗原决定簇组成、定植因子质粒与毒力编码基因的联系,对研制广谱重组菌毛疫苗具有重要指导意义。本文综述了近几年来有关定植因子菌毛的研究进展,以及与各类肠毒素编码质粒的相关性和疫苗研究概况。

细菌自然转化的机制及影响因素

水平基因转移对耐药基因传播、编码毒素基因质粒的扩散和毒力岛的转移等过程具有重要的生物学意义。自然转化是指具有感受态的细菌从外界摄取并整合裸露DNA,是水平基因转移的方式之一。细菌发生自然转化极大地促进了耐药基因在不同细菌间的播散,导致细菌对抗生素耐药,给临床治疗带来极大的困难。许多细菌具备自然转化能力,但不同细菌自然转化过程存在着差异。细菌自然感受及转化的诱发及效率亦受到多种因素的影响。文中着重于阐述不同细菌的自然转化机制及其影响因素。