血清4型禽腺病毒Ⅷ蛋白真核表达及其对LMH细胞天然免疫相关基因的影响

【目的】分析血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Ⅷ蛋白(ProteinⅧ,pⅧ)对宿主天然免疫相关基因表达的影响,为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列,与pEF1α-HA载体连接,构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒(试验组)和pEF1α-HA空质粒(对照组)转染LMH细胞,利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况,实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-κB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框(ORF)全长744 bp,共编码247个氨基酸残基,真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应,在34 kD处得到单一条带;间接免疫荧光检测可见绿色荧光,说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比,Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后,模式受体STING基因的表达水平显著提高5.6倍(P<0.05,下同),MDA5基因的表达水平提高30%;接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高1.5和2.4倍;转录因子IRF7的表达水平显著提高3.4倍,而NF-κB基因被抑制表达。同时,干扰素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β)的表达水平均上调,IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍(P<0.01),而IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β分别显著上调4.1、2.1、6.0和7.9倍。【结论】在LMH细胞中过表达FAdV-4 pⅧ,STING、MDA5、TBK1、MAVS、IRF7、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等天然免疫相关基因呈上调表达,表明Ⅷ蛋白对FAdV-4激发宿主的天然免疫具有一定促进作用。

Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞凋亡与自噬的影响

目的探究Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1(NEIL1)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的晶状体上皮细胞(LECs)凋亡与自噬的影响。方法以年龄相关性白内障(ARC)患者、接受透明晶状体摘除术的黄斑前膜患者的晶状体前囊膜样本和晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞为研究对象,采用RT-PCR实验检测NEIL1 mRNA表达。将SRA01/04细胞随机分为对照组、OE-Vector组和OE-NEIL1组,采用RT-PCR和Western blot检测过表达效率;将细胞随机分为对照组、H_(2)O_(2)组、OE-Vector H_(2)O_(2)组、OE-NEIL1 H_(2)O_(2)组,采用CCK-8法检测细胞活力,Western blot检测自噬相关蛋白(ATG7、P62、Beclin1、LC3-I和LC3-II)和凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达,荧光染色检测细胞凋亡与线粒体膜电位情况。结果ARC患者晶状体前囊膜样本中的NEIL1 mRNA表达显著低于黄斑前膜患者,且H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中NEIL1 mRNA的表达同样低于对照组(均为P<0.05)。RT-PCR与Western blot检测结果显示,OE-NEIL1组SRA01/04细胞中NEIL1 mRNA和蛋白表达均显著高于OE-Vector组(均为P=0.000)。与对照组相比,H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中细胞活力显著降低;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调;Mito-Tracker标记活细胞数显著减少,Annexin V-FITC标记的凋亡细胞数显著增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与OE-Vector H_(2)O_(2)组相比,OE-NEIL1 H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中细胞活力显著升高;自噬相关蛋白(ATG7、P62、Beclin1、LC3-I和LC3-II)表达均显著上调;Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调;Mito-Tracker标记的活细胞数增加,Annexin V-FITC标记的凋亡细胞数减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论在H_(2)O_(2)诱导氧化应激条件下,NEIL1可通过促进LECs的自噬,维持LECs内环境稳定,增加其细胞活力从而减少LECs凋亡,参与ARC的发生发展。

用蛋白Ⅷ在噬菌体表面展示抗体分子效果的观察

目的 观察抗体分子通过丝状噬菌体主要外壳蛋白Ⅷ（ｃｐⅧ）和次要外壳蛋白Ⅲ（ｃｐⅧ）在噬菌体表面呈现效果的差异。方法 分别构建通过ｃｐⅧ或ｃｐⅧ展示抗乙肝表面抗原（ＨＢｓ）Ｆａｂ、ＳｃＦＶ和抗角蛋白（Ｋｅｒ）Ｆａｂ的表达载体，制备噬菌体抗体，比较其抗原结合活性和Ｆａｂ呈现水平。用多种方法尝试提高ｃｐⅧ 介导的噬菌体展示效果。结果ｃｐⅧ对不同特异性抗体Ｆａｂ段和不同形式的小分子抗体（Ｆａｂ和ＳｃＦｖ）的展示效果均低于ｃｐⅧ的展示，增加 ｃｐⅧ-Ｆａｂ对野生型 ｃｐⅧ的表达比例、试用不同菌株、在Ｆａｂ和ｃｐⅧ之间插入间隔序列及换用控制更为严密的启动子等措施，均未能改善ｃｐⅧ介导的噬菌体展示。结论 以前所报道的通过ｃｐⅧ多价展示Ｆａｂ段不是普遍存在的现象，对有些抗体基因不能达到多价展示。

抗体分子在噬菌体表面蛋白Ⅷ上的展示

目的 观察抗体分子通过丝状噬菌体主要外壳蛋白Ⅷ和次要外壳蛋白Ⅲ在噬菌体表面呈现效果的差异。方法 分别构建通过次要外壳蛋白Ⅲ或主要外壳蛋白Ⅷ展示抗乙肝表面抗原Fab、ScFv和角蛋白Fab的表达载体 ,制备噬菌体抗体 ,比较其抗原结合活性和Fab呈现水平 ,用多种方法尝试提高主要外壳蛋白Ⅷ介导的噬菌体展示效果。结果 主要外壳蛋白Ⅷ对不同特异性抗体Fab段和不同形式的小分子抗体 (Fab和ScFv)的展示效果均低于次要外壳蛋白Ⅲ的展示 ,增加主要外壳蛋白Ⅷ Fab对野生型和主要外壳蛋白Ⅷ的表达比例、试用不同菌株、在Fab和主要外壳蛋白Ⅷ之间插入间隔序列、换用控制更为严密的启动子等措施 ,均未能改善主要外壳蛋白Ⅷ介导的噬菌体展示。结论 以前所报道的通过主要外壳蛋白Ⅷ多价展示Fab段不是普遍存在的现象 ,对有些抗体基因不能达到多价展示。

胶原蛋白ⅩⅧ——基底膜硫酸类肝素蛋白聚糖

胶原蛋白XⅧ(COL XⅧ)是一种十分保守的基底膜胶原蛋白成分,根据其蛋白质结构特点,它和COL XⅤ一起构成MULTIPLEXINs胶原亚家族。同时,它还含有丰富的硫酸肝素糖链,是迄今发现的第三个基底膜硫酸肝素蛋白聚糖。COL XⅧ基因具有两个结构不同的启动子区,由此产生组织分布各异的不同变体,它们在胚胎发育中具有器官特异的调控功能,特别是在视网膜发育中,完整的COL XⅧα1链必不可少。

急性运动负荷对Ⅱ糖尿病患者血浆因子Ⅷ相关蛋白、纤维结合蛋白及血清抗凝血酶Ⅲ的影响

本文观察了无血管并发症的Ⅱ型糖尿病患者在30min中等强度运动前后血浆因子Ⅷ相关蛋白,纤维结合蛋白及血清抗凝血酶Ⅲ活性的变化。提示适当运动对无血管并发症的Ⅱ型糖尿病患者不产生不良影响,推测运动疗法可能有助于延缓血管并发症的发生发展。

糖蛋白96、Raf-1和Nei内切核酸酶Ⅷ样蛋白2表达与鼻咽癌患者放射治疗敏感性的相关性

目的探讨糖蛋白96(gp96)、Raf-1及Nei内切核酸酶Ⅷ样蛋白2(NEIL2)在鼻咽癌(NPC)组织中的表达及其与放射治疗敏感性的相关性。方法选择2017年12月至2019年12月河南科技大学附属许昌市中心医院收治的125例疑似NPC患者为研究对象,根据病理组织学检查结果确诊为NPC 65例,鼻咽炎60例(对照组)。65例NPC患者确诊后均行放射治疗,放射治疗后根据治疗效果将患者分为放射治疗敏感组(n=48)和放射治疗抵抗组(n=17)。采用免疫组织化学法检测NPC组织和鼻咽炎患者鼻咽部黏膜组织中gp96、Raf-1及NEIL2蛋白的表达,采用Kendall分析gp96、Raf-1及NEIL2蛋白与NPC患者放射治疗敏感性的关系。结果放射治疗敏感组和放射治疗抵抗组患者NPC组织中gp96、Raf-1、NEIL2蛋白表达显著高于对照组,放射治疗抵抗组患者NPC组织中gp96、Raf-1、NEIL2蛋白表达显著高于放射治疗敏感组(P<0.05)。Kendall相关分析结果显示,gp96、Raf-1及NEIL2蛋白表达与NPC患者的放射治疗敏感性均呈显著负相关(r=-0.323、-0.618、-0.396,P<0.01)。结论NPC组织中gp96、Raf-1和NEIL2蛋白高表达,且gp96、Raf-1和NEIL2蛋白表达水平与NPC的放射治疗敏感性呈负相关,抑制gp96、Raf-1和NEIL2蛋白表达有望提高NPC的放射治疗敏感性。

ICP-MS测定注射用重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白中7个元素的迁移量

目的:建立电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定注射用重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白中钴(Co)、砷(As)、溴(Br)、镉(Cd)、锑(Sb)、钡(Ba)、铅(Pb)的迁移量,并对相容性长期放置的样品进行定量分析。方法:样品加纯化水0.75 mL,倒置复溶4 h后,用纯化水定容至5 mL,采用标准加入法测定待测溶液中7个元素的含量。ICP-MS工作参数:射频功率为1550 W,采样深度为10.0 mm,载气(氩气)流量为0.50 L·min^(-1),雾化器泵速为0.30 r·s^(-1),雾化室温度为2℃,稀释气流量为0.74 L·min^(-1),重复取样次数3次,分析模式为全定量。结果:各元素在各自的检测质量浓度范围内线性关系良好,元素加标回收率在92.0%~101.8%,应用于各加速放置点样品的检测时,除Br元素含量略有增长(增长迁移量分别为43.2、68.7、66.8 ng·mL^(-1))外,其余6个元素含量均远小于规定限度。结论:经方法学验证,本方法结果可靠,可用于注射用重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白样品中7个元素的迁移量测定。

Nei内切核酸酶Ⅷ样蛋白3在肝细胞癌中过表达提示免疫浸润水平增高和预后不良

目的通过癌症基因组图谱数据库评估Nei内切核酸酶Ⅷ样蛋白3(NEIL3)在肝细胞癌(HCC)中的作用及其分子机制。方法先用HCC样本的RNA测序数据分析基因NEIL3在正常组织和肿瘤中的表达水平。再通过基因本体论、京都基因与基因组百科全书、基因富集分析、免疫细胞浸润分析以对NEIL3进行功能和通路富集分析。根据NEIL3在肝癌组织的中位表达水平,将样本分为高表达组和低表达组,通过logistic回归分析、Kaplan-Meier分析、单因素和多因素Cox回归分析以及列线图预后模型探讨NEIL3在HCC中的临床及预后意义。结果与正常样本相比,NEIL3在包括HCC在内的大部分恶性肿瘤中高表达(P<0.05)。NEIL3高表达与细胞周期、DNA复制和细胞受体途径有关。此外,NEIL3高表达与辅助性T细胞2(Th2)的浸润水平呈显著正相关(R=0.670,P<0.001)。和NEIL3低表达组相比,NEIL3高表达患者肿瘤组织Th2细胞浸润水平更高(P<0.001)。Logistic回归分析显示NEIL3过表达与HCC的高T分期、高病理分期、高组织学分级、甲胎蛋白>400μg/L和血管浸润有关。Kaplan-Meier分析结果显示:NEIL3高表达患者的总体生存期[风险比(HR)=2.53,P<0.001]、疾病特异性生存期(HR=2.52,P<0.001)、无进展间隔期(HR=1.82,P<0.001)显著缩短,提示NEIL3高表达HCC患者预后更差。Cox回归分析结果显示:NEIL3高表达是HCC患者不良预后的一个独立危险因素(P=0.002)。列线图及校准图进一步说明NEIL3高表达是HCC患者预后不良危险因素之一。结论NEIL3表达升高与HCC不良预后和免疫细胞比例增加相关,其有望作为评估HCC预后和免疫浸润水平的潜在生物标志物。

A型血友病替代治疗药物凝血因子Ⅷ的临床研究进展

A型血友病(hemophilia A,HA)是一种罕见的X染色体连锁隐性遗传性出血性疾病,因血液中凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ,FⅧ)缺乏或者功能障碍所致。其发病率低,治疗费用高,且目前暂无有效的根治方法,按需替代治疗仍然是我国治疗HA最有效的方式。但目前HA患者需要终身用药,现有的药物半衰期短、注射频次高,易产生FⅧ抑制物,且患者的生存质量差。针对这种未被满足的临床需求,该文主要综述血源性人FⅧ、重组人FⅧ及长效重组人FⅧ-Fc融合蛋白3种替代治疗药物的临床研究进展,为后期药物研发及临床治疗提供新的思路和依据。

通过基因突变提高噬菌体蛋白Ⅷ介导的抗体Fab段的展示

目的 构建基因Ⅷ变种文库 ,筛选表面展示效率高的突变体 ,改进抗体分子在噬菌体表面的呈现效果。方法 通过重叠PCR ,在基因Ⅷ引入随机突变 ,克隆到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)的噬菌体抗体表达载体中 ,使抗HBsAg的Fab段通过蛋白Ⅷ展示于噬菌体表面 ,构建蛋白变种Ⅷ文库 ,筛选能使HBsAg表面呈现效果得到提高的蛋白Ⅷ突变体。结果 构建了一个库容为 6× 10 8的基因Ⅷ变种文库 ,使用游离抗原竞争、硫氰酸盐洗涤等方法进行淘筛 ,获得多个展示活性高于野生型蛋白Ⅷ的突变体 ,其中 2个最好的变种可使表面呈现效果提高 5 0～ 70倍。结论 通过对基因Ⅷ的改造可提高其对抗体Fab段的展示性能 ,获得 2株可使展示活性提高 5 0～

湖北和河南地区汉族人群NEIL3 rs12645561多态性与冠状动脉硬化严重程度的相关性研究

目的评估湖北和河南两地区汉族人群Nei核酸内切酶VIII样蛋白3(NEIL3)基因rs12645561多态性位点与冠状动脉硬化严重程度的相关性。方法以947例经冠状动脉造影病例为研究对象,采用病变支数得分和Gensini得分评估冠状动脉硬化严重程度;采用高分辨率熔解曲线进行rs12645561基因分型;ELISA法检测血浆NEIL3蛋白水平。结果 rs12645561 T风险等位可增加冠心病风险(χ2=12.165,P<0.05),并与病变支数得分和Gensini得分明显相关(χ2分别为14.745和15.615,P<0.05);rs12645561 CT+TT风险基因型、体重指数>25 kg/m2、高脂血症和吸烟是Gensini得分增高的独立危险因素(OR分别为1.50、1.54、2.01、1.42,P<0.05);血浆NEIL3蛋白表达水平与rs12645561基因型分布、病变支数得分和Gensini得分呈负相关(P<0.05)。结论 rs12645561与湖北和河南地区冠状动脉硬化严重程度密切相关,并可影响NEIL3蛋白表达。

冷沉淀质量事件可追溯性的调查与分析

目的探讨与分析形成冷沉淀质量事件的关键因素并予以整改。方法收集中心2016年10月到2018年8月冷沉淀制品的外观、容量、FⅧ因子含量、纤维蛋白原含量和无菌检查五个项目抽检结果,从采血到冷沉淀制备的每个环节分析形成质量事件的因素。结果2017年及之前的冷沉淀质量控制抽检结果显示不合格数为13袋,其中FⅧ因子含量未达标数占据84.62%,纤维蛋白原含量不达标数占据23.08%,其中1袋为二者均不合格。通过对上述各环节的不断改进和控制,2018年1~8月冷沉淀质量控制抽检合格率高达96.88%。结论杜绝质量事件的关键是保证血液的冷链系统,最大限度的减少冷沉淀在常温下的时间。要保证各个环节的严格受控,制备优质冷沉淀,除了配备必要的设备外,还要提高员工的质量意识和效率意识,提高专业技能。

因子Ⅷ相关抗原检测在流行性出血热的临床意义

因子Ⅷ是由因子Ⅷ促凝成分(Ⅷ:C)及其抗原成分(Ⅷ:CAg)以及因子Ⅷ相关蛋白(Ⅷ:R)组成的复合物.Ⅷ:R的抗原部分称因子Ⅷ相关抗原(ⅧR:Ag).它们具有多种与凝血有关的活性因子,测定这些因子有助于诊断血友病甲和血管性假血友病,且是反映高凝状态的指标之一.本文就对189例流行性出血(EHF)测定ⅧR:Ag的结果,及其变化的临床意义略加探讨.

BIRC5、NEIL2表达水平与鼻咽癌放疗敏感性的相关性

目的探讨含重复凋亡结构杆状病毒抑制剂5(BIRC5)、内切核酸酶Ⅷ样蛋白2(NEIL2)与鼻咽癌(NPC)患者放疗敏感性的关系。方法选取2012年4月-2014年4月于本院诊治的NPC患者56例(NPC组),选取同期鼻咽炎患者50例作为对照组。根据随访结果,将NPC患者分为放疗敏感组(n=42)和放疗不敏感组(n=14),采用免疫组化SP法检测病理组织BIRC5、NEIL2水平,比较二者在NPC组和对照组中差异,以及在NPC患者中治疗前后的变化。结果与对照组比较,NPC组患者BIRC5、NEIL2相对表达量均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。放疗前敏感组患者BIRC5、NEIL2相对表达水平显著低于不敏感组(P<0.05),放疗后敏感组患者NEIL2相对表达水平明显低于不敏感组(P<0.05)。BIRC5、NEIL2预测NPC放疗敏感性ROC曲线下面积分别为0.839、0.817,敏感性分别为79.12%、78.77%,特异性分别为79.53%、79.86%,约登指数分别为0.587、0.586。BIRC5低表达者3年存活率明显高于BIRC5高表达者(94.87%vs. 70.59%,P<0.05);NEIL2低表达者3年存活率明显高于NEIL2高表达者(97.14%vs. 71.43%,P<0.05)。结论 BIRC5、NEIL2在鼻咽癌患者中高表达,且与患者3年生存率相关,对NPC患者放疗敏感性具有一定预测价值。