27例乙型血友病患者Ⅸ因子基因突变研究

采用ＰＣＲ（聚合酶链反应）及ＧＡＷＴＳ（ＧｅｎｏｍｉｃＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术，研究了江苏、湖北、山东、广东、福建、宁夏六省区２７例乙型血友病患者及其家系成员ＦⅨ（九因子）基因各２．２Ｋｂ ＤＮＡ序列。在２ｌ例中发现２０种不同类型的突变。其中１２种是未曾报道的新突变。３８％的突变发生在ＣｐＧ二核苷致序列上，进一步证实了ＣｐＧ确系突变热点。同时检出６例女性为致病基因携带者。对开展基因产前诊断及优生优育等，具有重要意义。

携带人Ⅸ因子基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨髓细胞中的表达

构建携带人Ⅸ因子。cDNA的逆转录病毒载体MFGⅨ,并观察其在造血细胞中的表达。应用DNA重组技术将人Ⅸ因子cDNA构建入MFG载体,转导入包装细胞系PA317细胞,应用病毒上清转染造血细胞,并用PCR,ELISA及免疫组化方法检测其表达。研究结果表明,酶切鉴定成功构建MFGⅣ逆转录病毒载体,转入HT1080细胞系及小鼠骨髓细胞后,用PCR,ELISA及免疫荧光染色和免疫细胞化学染色证实Ⅸ因子的表达,且ELISA结果显示应用MFGⅨ转染Ⅸ因子蛋白及活性均高于LNCⅨ。结论提示MFGⅨ载体能较好转染造血细胞。

先天性凝血Ⅸ因子缺乏症2例报告

先天性凝血Ⅸ因子缺乏症２例报告王淑娟，吴振茹，王建中北京医科大学第一医院（１０００３４）先天性Ⅸ因子缺乏症（血友病乙）较为少见，笔者于１９９５年发现２例，报道如下。１病历报告【例１】梁某，男性，４岁３个月。患儿自３岁５个月起无明显诱因出现间断性鼻出血...

重组慢病毒介导人凝血Ⅸ因子基因感染HUCMSCs的实验研究

目的探讨慢病毒介导人凝血Ⅸ因子(human clotting factorⅨ,hFⅨ)感染人脐带间充质干细胞(human um-bilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)后hFⅨ的表达情况。方法重组构建慢病毒载体GV240-hFⅨ-EGFP。以脂质体介导法共转染293T细胞包装生产慢病毒。以不同感染复数(multiple of infection,MOI)感染hUCMSCs,荧光显微镜观察细胞感染效率,流式细胞仪检测验证。以最适MOI感染hUCMSCs,RT-PCR检测hFⅨmRNA水平,ELISA检测FⅨ蛋白含量(FⅨ∶Ag)及一期法检测FIX凝血活性(FⅨ∶C)。结果制备出了滴度为2×108TU/mL的重组慢病毒。MOI=10时能高效感染hUCMSCs,感染效率为(92.92±6.32)%。RT-PCR结果示只有转染组有hFⅨmRNA转录。感染后1 d,hUCMSCs即可有效分泌hFⅨ,在5 d时达到最高峰,FⅨ∶Ag为(87.18±0.86)ng/(106.24 h),FⅨ∶C为(44.3±3.2)%,高水平分泌可至少持续29 d。结论重组GV240-hFⅨ-EGFP慢病毒感染hUCMSCs后能持续高水平分泌具有凝血功能活性的hFⅨ蛋白。

直接注射含人Ⅸ因子cDNA质粒在小鼠体内的表达

本文报道了２种分别由人巨细胞病毒（ｈＣＭＶ）启动子和ＳＶ４０早期启动子控制的人Ⅸ因子ｃＤＮＡ质粒ｐＣＭＶ─Ⅸ，ｐＫＧ５─Ⅸ直接注射小鼠骨骼肌内，在肌细胞中可产生Ⅸ因子蛋白，并分泌至血液中，在注射后约第１０ｄ表达量最高，最高含量可达２５ｎｇ／ｍｌ。为采用直接注射法进行遗传病基因治疗提供１种可能。

凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ活性检测影响因素的分析

目的 验证离心力对凝血因子FⅧ(FⅧ)活性和凝血因子FⅨ(FⅨ)活性检测的影响。方法 用全自动血凝分析仪测定室温700 g、1500 g、396 g和4℃1000 g、1500 g离心15 min以及4℃2700 g离心10 min,不同离心力条件下即刻和冷冻后48 h FⅧ和FⅨ的活性并进行数据统计分析。结果 6种不同离心方法得到的血浆,不管是立即检测还是冻存后检测,FⅧ和FⅨ的活性水平在不同离心力条件下没有显著性差异(P>0.05),同一离心力条件下冷冻后FⅧ活性水平跟即刻检测结果有统计学差异(P<0.05),同一离心条件下FⅨ活性在即刻和冷冻后检测结果无统计学差异(P>0.05)。结论 从离心机类型、离心力转速到离心时间和离心温度多方面分析,在一定离心力范围内不同离心力对FⅧ活性和FⅨ活性检测的影响不大,冻融会影响凝血因子Ⅷ活性水平检测,凝血因子Ⅸ活性检测不受冻融影响。

人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究

以小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件，牛β－酪蛋白（β－casein）基因5＇端2．0kb调控顺序，人凝血Ⅸ因子小基因（hFIXminigene）构建乳腺组织特异性表达载体，表达载体和质粒pSV－neo共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），兔皮肤纤维细胞（RSF）和人胚肾上皮细胞（293细胞）．发现hFIX基因在CHO细胞中获得低水平表达，最高表达量为7．2ng／ml．在皮肤成纤维细胞中的表达量低于2ng／ml．在293细胞中没有表达．表达载体用stearylamine（SA）脂质体包埋后尾静脉注射哺乳期小鼠，hFIX蛋白在小鼠乳汁中表达水平高达87．34ng／ml．

多聚酶链式反应应用于带入Ⅸ因子cDNA的转基因小鼠的初筛

在转基因小鼠的制备中,对于所导入外源DNA的检测一般采用DNA-DNA分子杂交法.由于它具有敏感性和可靠性高等优点,故它在转基因小鼠的研究中是不可少的.然而,这种方法在实际应用中也有一些缺点,如操作复杂、工作量大、实验周期长、DNA样品量大以及放射性同位素来源的时间限制等,这些都给转基因小鼠的制备带来了一定的困难.我们在人凝血IX因子(Clotting factor IX)转基因小鼠的制备中,将多聚酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)技术应用于转基因小鼠的初筛,并与Southern杂交结果进行了比较.结果表明这种方法是可行的,其最大的优点是提高了效率,缩短了实验周期.

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平

人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价测定影响因素的探讨

目的 探讨几种因素对人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价测定的影响。方法 参照《中国药典》2010年版,采用不同厂家乏Ⅸ因子血浆、不同型号仪器、不同肝素中和方式、不同样品前处理方法测定人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价,分析其对PCC中凝血因子Ⅸ效价测定结果的影响。结果 不同厂家的乏Ⅸ因子血浆对凝血因子效价测定结果有显著性差异（P〈0.05）。不同型号全自动凝血分析仪对凝血因子效价测定结果无显著性差异。当稀释倍数大于60倍时,是否中和肝素对凝血因子Ⅸ效价测定结果影响较小。当稀释倍数小于60倍时,中和肝素的检测结果高于不中和的检测结果,差异有统计学意义（P〈0.05）。样品预温与否及是否复溶15分钟,凝血因子Ⅸ效价测定结果无显著性差异。结论 不同厂家乏Ⅸ因子血浆,不同稀释倍数的肝素中和方式,样品前处理方法均影响PCC制品凝血因子Ⅸ效价的测定,在检测过程中应予以重视。加强对乏因子血浆的质量控制及操作流程的规范化,建立PCC制品凝血因子检测的室间质量评价体系。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(humanclottingfactorIX ,hFIX)的可行性 ,构建了包括山羊 β 酪蛋白基因启动子和外显子 1、内含子 1、外显子 2共约 6 .7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子 1的乳腺表达载体 ,通过转基因技术获得 12个原代转基因小鼠 (9♀ ,3♂ ) ,整合率为 11.2 %。经ELISA和Westernblot鉴定 8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性 ,其中一只的表达量高达5 2 .9mg/L ,其凝血活性亦高达 2 79.2 %。FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上。结果证明所构建的山羊 β 酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达 ,并能保持hFIX的生物活性。

应用荧光原位杂交检测人凝血因子Ⅸ在转基因小鼠染色体上的整合

应用荧光原位杂交 (FISH)技术检测两个转基因小鼠家系从F1到F4 代的整合情况。阳性转基因小鼠 98%～ 10 0 %的中期分裂相 ,85 %～ 94%的间期核出现杂交信号 ;阴性对照小鼠 10 0 %的中期分裂相、95 %～ 96 %的间期核未出现杂交信号。结果表明 ,该FISH实验条件能对转基因整合位点进行高效特异检测。本文分析的两家系转基因小鼠均为单位点整合 ,但整合位点不同。各家系内F1到F4 代的转基因小鼠均可检出整合染色体 ,且整合位点相同 ,表明外源基因稳定整合并遗传给后代。

人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器的研制

为了建立人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器，以MCK增强子，β－actin启动于控制hFIX小基因（minigene）表达顺序，反向插入G1Na框架，构建复制缺陷反转录病毒载体，并制备重组反转录病毒颗粒；以CMV启动子，hFIXcDNA和腺病毒框架构建腺病毒载体pAdCMVhFIX，与质粒pJM17共转染包装细胞制备合hFIX基因的重组腺病毒颗粒．两种病毒颗粒分别通过直接转染活体奶山羊乳腺组织，建立了hFIX蛋白的乳腺表达系统和快速检测系统．另外，利用小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件，牛β－Casein基因，人凝血Ⅸ因子小基因和cDNA构建了乳腺组织特异性表达载体．以Stearylamine（SA）阳离子脂质体介导、尾静脉注射的方法转染哺乳期雌性小鼠的活体组织，建立Ⅸ因子表达的快速检测系统，并研究了β－casein基因，hFIX基因intron1对hFIX基因在乳腺组织中表达调控的作用．在此基础上将筛选得到的pMCIXm表达载体通过显微注射技术注人小鼠和奶山羊受精卵细胞，制备6只转基因小鼠和5只转基因奶山羊．其中在2只转基因小鼠和1头奶山羊乳汁中测得hFIX蛋白的表达并具有凝血活性．

小鼠胚胎干细胞凝血因子Ⅸ基因的定向敲除

目的：将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ（ｍＦⅨ）基因定向敲除，为建立血友病Ｂ的转基因小鼠模型奠定基础；摸索建立ＥＳ细胞基因打靶技术体系。方法：将线性化的针对小鼠ｍＦⅨ基因组的基因打靶置换型载体（ｐＭＦⅨＤＥＬ）ＤＮＡ用电穿孔法转入小鼠ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，用ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交两种方法，鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况。结果：（１）从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了４个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ＥＳ细胞克隆；（２）观察到在ＥＳ细胞中，ｐＭＦⅨＤＥＬ载体ＤＮＡ与内源ｍＦⅨ基因发生同源重组的频率平均为１．６７×１０－６。结论：得到了４个ｍＦⅨ基因已被敲除的ＥＳ细胞克隆；建立了ＥＳ细胞基因打靶的技术体系。

人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价检测中影响因素的探讨

目的探讨人凝血酶原复合物(PCC)中凝血因子Ⅸ效价检测的影响因素,优化检测条件。方法研究不同的Ca2+浓度对一期法检测凝血因子Ⅸ效价的影响,并分别考察磷酸三丁酯、聚山梨酯-80(S/D)以及硫酸鱼精蛋白中和肝素对检测的影响。结果 Ca2+浓度为0.012 5 mol/L时,检测结果最稳定,标准曲线的相关性(r2)为0.999±0.001,回收率为(99.2±1.789)%,5次重复试验的变异系数为1.80%;S/D对PCC样品中凝血因子Ⅸ效价检测的影响无统计学意义(P>0.1);PCC样品的肝素未中和时,稀释倍数的影响较大,中和后凝血因子Ⅸ效价受稀释倍数影响较小。结论优化了凝血因子Ⅸ效价检测的影响因素,最优Ca2+离子浓度为0.012 5 mol/L;S/D试剂无影响;硫酸鱼精蛋白中和肝素后,凝血因子Ⅸ效价受稀释倍数影响较小。

我国脑血栓患者家系凝血因子Ⅸ基因SNP9的检测

目的 探讨凝血因子 基因在第六外显子 2 3384- 2 3387bp存在单核苷酸多态性 (SNP9)在我国北方人群脑血栓发病机制中的作用。方法 应用聚合酶链反应 -限制性片断长度多态性 (PCR- RFL P)的方法 ,检测 2 0例脑血栓患者和他们家系及 6 0例正常健康对照组凝血因子 第六外显子 2 3384- 2 3387bp多态性分布。结果 2 0例脑血栓患者和 40例他们的家系成员 ,在 Mn II酶切后 ,可见 30 7bp片断基因类型全部是 A。正常 6 0例健康对照组基因多态性基因型也显示为 A,而在阳性对照可见 A、G和 AG。结论 在这一等位基因位点脑血栓家系和正常人群基因多态性基因型均为 A型。这一位点基因对我国脑血栓患者的作用机制有待于进一步探讨。

批式吸附法制备人凝血因子Ⅸ复合物(英文)

目的 制备纯度较高 ,潜在血栓性小的凝血因子Ⅸ (FⅨ )复合物。方法 以人新鲜冰冻血浆为原料 ,采用SD病毒灭活工艺 ,经国产DEAE SepharoseFastFlow胶批式吸附和Ca3 (PO4) 2 吸附制备凝血因子Ⅸ复合物。结果 两步的活性收率分别为 ( 89.94± 1.31) % (n =7)、( 82 .2 7± 2 .18) % (n =6 ) ,制品的FⅨ∶C比活为 ( 16 .2 8± 2 .80 )IU/mg。FIX的量为 ( 12 6 .82±11.6 0 )IU/瓶 ( 2 0 0PE)。结论 本工艺实用性较高 ,可用于制备低成本 ,高质量的凝血因子Ⅸ复合物。

吡咯烷类活化Ⅸ因子抑制剂的设计、合成及活性研究

目的活化Ⅸ因子(FⅨa)是针对静脉血栓疾病研究中十分具有吸引力的靶点。为了寻找安全、有效、用药便捷的新型口服抗凝药物,针对FⅨa靶点设计了18个吡咯烷类化合物。方法经过烷基化反应、酰基化反应、迈克尔加成反应、缩合反应、水解反应等对目标化合物进行化学合成,所获得的化合物经过^(1)H-NMR、MS等手段进行了结构确证;采用离体酶抑制法测定化合物的FⅨa抑制活性。结果发现了苗头化合物A_(i)显示出FⅨa抑制活性。结论通过分子对接模拟化合物A_(i)和阳性对照CFM-184与靶点的作用模式,揭示了二者的差异,为后续FⅨa抑制剂的研发提供思路。

重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。