RT-PCR法检测肾癌组织中MN/CAⅨ基因表达

目的评价RT-PCR法检测MN/CAⅨ基因在肾癌组织表达的可靠性。方法以5例肾癌和5例正常肾组织为研究对象,提取总RNA,两步法进行RT-PCR反应,用MN/CAⅨ的特异性引物扩增,2%琼脂糖凝胶电泳后观察并测序。结果经过测序证实5例肾癌组织的RT-PCR产物中有4例可见特异的MN/CAⅨ条带,而正常肾组织的RT-PCR产物均无相应的MN/CAⅨ条带。结论RT-PCR法检测MN/CAⅨ在肾癌组织中的表达是准确、可靠的。

凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠近交系的建立

目的 :建立可稳定遗传、临床症状显著的凝血因子 (F )基因剔除小鼠近交系。 方法 :以 PCR扩增检测小鼠尾组织 DNA,一期法检定小鼠血浆 F 活性和血浆凝血酶原时间 (PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)值 ;取以上结果为全阳性的小鼠以选优法进行全同胞兄妹交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,第 8代开始筛选纯合子。 结果 :F8代 F 基因剔除小鼠PCR检测阳性率 92 % ,到 F1 2 代小鼠阳性率达 10 0 % ;F 活性 (2 .4 7± 1.75 ) %较正常小鼠 (14 8.18± 4 6 .98) %明显降低 (P<0 .0 1) ;F 基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,遗传性状稳定 ,并有自发出血倾向。结论 :成功建立了纯合子 F 基因剔除小鼠近交系 ,该小鼠符合人血友病

中国汉族人群凝血因子Ⅸ基因限制性片段长度多态性的研究

为探讨中国人群中凝血因子Ⅸ ( FⅨ )基因SalⅠ ,NruⅠ和MseⅠ酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP) ,采用聚合酶链反应 (PCR)方法 ,以三代内相互间无亲缘关系的正常汉族人为研究对象 ,对其 FⅨ基因内含子 1第 192位以及 5′端 - 793位核苷酸A和G的频率和 5′端 - 6 98位核苷酸T和C的频率进行了分析 ,其中对FⅨ - 192共分析了 2 14条X染色体 ,对 FⅨ - 793共分析了 2 10条X染色体 ,对 FⅨ - 6 98共分析了 2 0 6条X染色体。结果表明 :FⅨ基因内含子 1第 192位A和G的频率分别为 0 .878和 0 .12 2 ,杂合体频率为 0 .2 13;- 793位核苷酸A和G的频率分别为 0 .5 5 2和 0 .4 4 8,杂合体频率为 0 .4 94 ;FⅨ - 6 98位核苷酸T和C的频率分别为 0 .311和 0 .6 89,杂合体频率为 0 .4 2 9。结论提示 :FⅨ基因SalⅠ。

巨大血小板综合征GP Ⅸ基因纯合突变1例并文献复习

目的报道1例巨大血小板综合征GPⅨ基因纯合突变患儿,并探讨其临床表现及实验室检查特点,梳理诊断思路和治疗方法。方法回顾性分析1例巨大血小板综合征GPⅨ基因突变患儿的临床特征、实验室检查、基因测序及诊治经过,并复习相关文献和讨论。结果 14岁女性患儿,表现为反复鼻衄、月经量大、血小板减少、血小板体积增大、血红蛋白降低。GPⅨ基因纯合突变:[c.105G>A,p.35W>X],父母热点基因突变验证显示父亲为杂合携带者,母亲不存在相应位点突变。结论本研究患儿是GPⅨ基因突变、血小板膜糖蛋白缺陷所致的出血疾病,早期诊断、早期预防和正确治疗利于患儿健康成长。

血友病乙患者因子Ⅸ基因突变的研究

目的：探讨血友病乙患者的分子缺陷。方法：应用聚合酶链反应、单链构象多态性和ＤＮＡ直接测序法，检测３例血友病乙患者因子Ⅸ基因包含外显子Ⅱ的经扩增的ＤＮＡ片段。结果：发现３例均在６３６４位核苷酸发生碱基替换Ｃ（ＣＧＧ）→Ｔ（ＴＧＧ），由于该位点位于指导前导肽合成的第Ⅱ外显子上，所以导致前导肽（－４位）的精氨酸变成色氨酸，影响了前导肽的裂解，从而降低因子Ⅸ的凝血活性。

变性梯度凝胶电泳检测到四例新的FⅨ基因突变

目的：研究凝血因子Ⅸ的基因突变。方法：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）筛选技术，分析了１２例血友病Ｂ患者ＦⅨ基因的全部８个外显子，剪接区及３′，５′端部分非编码区，并对ＤＧＧＥ行为异常片段进行双脱氧链终止法ＤＮＡ序列分析。结果：发现４例新的基因突变，分别位于ＦⅨ基因第１号外显子Ｔ（ＴＧＴ）１１１Ｇ（ＧＧＴ），导致Ｃｙｓ－１９Ｇｌｙ；第３号内含子剪接位点Ｃ１０３８０Ｔ和第８号外显子Ａ（ＴＡＣ）３０９１８Ｇ（ＴＧＣ），导致Ｔｙｒ２６６Ｃｙｓ；第８号外显子Ａ（ＡＣＧ）３１００７Ｃ（ＣＣＧ），导致Ｔｈｒ２９９Ｐｒｏ。结论：阐明血友病Ｂ的点突变有助于进一步了解ＦⅨ蛋白各功能域的精细功能，并为血友病Ｂ家系携带者检测和产前诊断提供了一个重要的遗传信息。

肾癌肿瘤相关抗原G250/MN/CAⅨ基因的克隆、表达及鉴定

目的报道G250/MN/CAⅨ基因的克隆,蛋白表达及鉴定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RTPCR法扩增G250/MN/CAⅨ全长cDNA,将获得的cDNA片段插入pET22b(+)表达载体,转化BL21大肠杆菌中,以IPTG诱导进行蛋白表达,SDSPAGE凝胶电泳观察结果,实验验证。结果克隆的G250/MN/CAⅨ基因经测序证实序列正确,构建重组质粒pET22b(+)/G250并在原核系统中表达G250/MN/CAⅨ重组蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论成功完成G250基因克隆,为在G250蛋白纯化基础上进行抗体制备和G250功能研究提供了实验依据。

腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34^+造血干/祖细胞中的表达

目的研究2型重组腺相关病毒(rAAV-2)介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在脐血CD34+细胞及其子代细胞中的表达。方法采用rAAV-2/hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34+细胞,分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21d,从转录水平、蛋白质水平和其功能活性检测hFⅨ的表达,同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、各系标志分化抗原的表达及集落产率来评估rAAV-2对其增殖分化能力的影响。结果经测序证实转导组子代细胞的RNA可扩增出hFⅨcDNA片段,上清液中可检测到hFⅨ抗原的表达,每24h分泌量达14.10ng/106细胞。转导组和未转导组细胞培养21d后其活力、增殖倍数、标志性分化抗原的阳性率及集落产率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论rAAV-2/hFⅨ能有效地转导人脐血CD34+细胞并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,且对其体外培养21d的细胞增殖分化能力无明显影响。

重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。

实时定量PCR检测氟对软骨细胞COLⅨA3基因表达的影响

目的:探讨氟对体外培养软骨细胞中COLⅨA3基因mRNA的表达影响。方法:采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行实时定量PCR的方法,检测不同剂量氟对体外培养软骨细胞中COLⅨA3基因mRNA的表达影响,染氟剂量分别为0、5、10、20、40mg/L,染氟10d。结果:实时定量PCR检测显示各组均可检测到COLⅨA3mRNA,相对定量比由对照组到高剂量组约为:100:134:200:104:129,染氟实验组中5mg/L、10mg/L组表达量高于对照组和40mg/L组,且以10mg/L组表达量最高,是对照组的2倍。随着染氟剂量增加,软骨细胞COLⅨA3基因mRNA表达量降低。结论:不同剂量氟对软骨细胞中COLⅨA3基因mRNA表达的影响不同,低剂量氟可以促进COLⅨA3基因mRNA的表达,随剂量增加氟的促进作用减弱。

中国人群组织因子途径抑制物基因外显子Ⅸ1006G→A突变与冠心病的关系

目的 :探讨中国人群冠心病患者和正常人组织因子途径抑制物 (TFPI)基因Ⅸ外显子 10 0 6位G→A突变的发生率及该突变与中国人群冠心病的关系。方法 :采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(PCR RFLP)方法分析 ,对 5 3例冠心病患者和 5 3例对照者进行TFPI基因外显子Ⅸ 10 0 6G→A突变分析。结果 :5 3例患者和 5 3例对照者中均未发现该突变。结论 :TFPI基因外显子Ⅸ 10 0 6G→A突变不是中国人群冠心病的危险因素 ,中国人群TFPI基因外显子Ⅸ 10 0 6A等位基因频率极低。

一株鸭源基因Ⅸ型新城疫病毒广西分离株的生物学特性及全基因序列分析

为全面了解广西分离株GX19/2011的生物学和遗传特性,对分离株的鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡胚静脉接种致病指数(IVPI)和对鸭的致病力进行测定,并对其全基因遗传特性进行研究研究。结果显示:该分离株的ELD50为10-9.48/0.1 mL、MDT为51.4h、ICPI为1.80、IVPI为2.82。使用该毒株分别感染35日龄和50日龄的鸭,发病率均为100%,死亡率分别为100%,70%。该毒株全长为15192bp,与F48E8和GD09-2等参考毒株的亲缘关系较近,均属于基因Ⅸ型。该分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-R-R-F117,具有强毒株的典型特征。生物学特性和遗传进化分析结果都表明该毒株为速发型强毒株,同时对鸭具有较强的致病力。

血友病B家系的基因测序与高危胎儿的产前诊断

目的:对3个血友病B家系进行凝血因子Ⅸ(F9)基因突变分析,并对家系中的4个高危胎儿行产前诊断。方法:采用PCR反应和扩增后DNA直接测序技术对3个家系先证者及其家系成员F9基因的8个外显子进行序列分析,确定先证者及携带者的基因型后取羊水或绒毛进行产前诊断。结果:3个家系患者中均检出了F9基因突变,分别为G79R(c.10487G>A)、17788DelG、IVS2+4A>T(c.6493A>T)突变,其中,17788DelG为国内外首次报道的突变。女性携带者中检测出上述位点的杂合突变。家系1和家系2中行产前诊断的男性胎儿未携带F9基因突变,家系3中女性胎儿携带有IVS2+4A>T杂合突变,出生后随访均证实产前诊断的结果。结论:F9基因G79R、17788DelG、IVS2+4A>T是3个血友病B家系的致病性突变,应用基因测序技术可以对血友病B家系行有效的基因和产前诊断。

腺病毒载体中凝血因子IX基因表达的电镜检测

腺病毒载体中凝血因子ＩＸ基因表达的电镜检测王琪卢大儒邱信芳薛京伦颜永碧郑尊（复旦大学遗传学研究所，上海２００４３３）（第二军医大学中心实验室）人凝血因子ＩＸ基因（ＨｕｍａｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＩＸ，ｈＦＩＸ）缺陷可导致遗传性出血性疾病，...

重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中的表达

目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子IX基因(rAAV-2/hFIX)在人/鼠结肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞株)中的表达。方法:重组腺相关病毒/绿色荧光蛋白(rAAV-2/GFP)感染SW480/C26细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达,计算转染率。rAAV-2/hFIX感染SW480/C26细胞,检测hFIX基因、FIXAg量及hFIX活性的表达。结果:SW480细胞株/C26细胞株GFP48hr阳性率分别为(57.0±8.5)%和(48.0±5.7)%;转导组14 d和21 d均可见外源hFIX的cDNA片断。SW480细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天和第21天ELISA法测hFIX抗原量分别为(98.0±4.3)和(30.9±6.5)ng.106cell-1.24h-1。未转导组为(2.7±0.1)ng.106cell-1.24h-1。C26细胞转导了rAAV-2/hFIX后在第2天测hFIX抗原量为(78±5.12)ng.106cell-1.24h-1。未转导组为(2.9±0.1)ng.106cell-1.24h-1。hFIX活性与hFIX抗原浓度明显相关。较对照组亦显著增高。结论:rAAV-2/GFP能有效地转导SW480/C26细胞。rAAV-2/hFIX能有效地转导SW480/C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFIX。

糖蛋白IX基因Ala 139→Thr突变导致的巨大血小板综合征

目的:对1例有血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ缺失的巨大血小板综合征(BSS)患者的GPⅠb/Ⅸ的基因进行系统的研究。方法:用PCR扩增GPⅠbα.GPⅠbβ与GPⅨ基因全长编码序列并做DNA序列分析。用限制性内切酶HPYCH4Ⅲ对GP Ⅸ的基因片断做酶切位点分析。用定点诱变技术制备突变质粒并通过脂质体转染技术转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用流式细胞术比较野生型与突变CHO细胞表面的GPⅠb/Ⅸ表达。结果:在GP Ⅸ cDNA的688 bp位置发现G→A突变,导致CPⅨ跨膜区139 Ala(GCC)被Thr(ACC)取代。该突变为一种国际上尚未报道的BSS新的基因突变。限制性酶切位点分析显示患者为纯合子,而家庭的其它成员为杂合子。野生型细胞表面有大量的GPⅠb/Ⅸ,但突变型细胞几乎无GPⅠb/Ⅸ表达。结论:研究表明本例BSS患者的发病机理为GP Ⅸ Ala139(GCC)→Thr(ACC)突变,并提出GP Ⅸ跨膜区结构对维持GPⅠb/Ⅸ在血小板正常表达与可能中的重要意义。

人类因子IX基因缺陷的研究

本实验对同一家系3例血友病乙男患者进行因子IXI基因缺陷的研究,应用多聚酶链反应扩增因子IX基因外显子2的338bp DNA片段,扩增产物行单链构型多态性(SSCP)检查,发现三例均出现多态性变化.纯化该三例PCP扩增产物DNA,并行双链DNA直接荧光自动测序,发现三例都在6364位发生碱基替换,C(CGG)→T(TGG),该基因点突变改变了正常FIX的结构和凝血功能,因而导致血友病乙.该研究对揭示血友病乙分子缺陷的发生机制有重要意义,并有助于血友病.乙携带者的检查和产前基因诊断,而且对血友病己患者的基因治疗有直接指导意义.

中国脑血栓患者家系凝血因子IX基因SNP9的检测(英文)

目的凝血因子Ⅸ基因在第六外显子23384～23387bp存在单核苷酸多态性(SNP9)。探讨这一单核苷酸的多态性在中国北方人群脑血栓发病机制中的作用。方法应用聚合酶链反应—限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)的方法,检测20个脑血栓患者和他们家系,60例正常健康人群凝血因子Ⅸ第六外显子2338～23387bp多态性分布。结果20例脑血栓患者和40例他们的家系成员,在MnⅡ酶切后,可见307bp片断基因类型全部是A。对照组60例基因多态性基因型也显示为A,阳性对照可见A、G和AG。结论在这一等位基因位点脑血栓家系和正常人群基因多态性基因型均为A型。

凝血因子IX基因剔除小鼠的培育历史与建系方法

目的 培育凝血因子IX基因剔除小鼠近交系。方法 采用全同胞兄妹对交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,记录繁殖性能 ;第 8代开始筛选纯合子。结果 凝血因子IX基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,交配年龄 70 - 90d ,平均每窝产仔数 5只以上 ,离乳数 3只以上。