重组Ⅸ蛋白检测犬传染性肝炎病毒抗体间接ELISA方法的建立

[目的]建立用重组蛋白Ⅸ检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。[方法]分别设置不同抗原包被浓度、包被条件、封闭液等,比较ELISA反应效果。[结果]最佳抗原包被浓度为5.0μg/ml;最佳包被条件为,37℃包被1 h、4℃过夜;最佳封闭液为5%BSA;HRP-羊抗犬IgG的最佳工作浓度为1∶1 600。[结论]建立了检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。

Yes相关蛋白及碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表达与鼻咽癌发生发展的关系

目的探讨鼻咽癌组织中Yes相关蛋白(YAP)、碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表达与肿瘤发生发展的关系。方法选取鼻咽癌组织标本80例为鼻咽癌组,鼻咽黏膜慢性炎症组织80例为对照组,采用免疫组化染色检测2组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达情况,并分析不同年龄、性别及病理学特征的鼻咽癌组织中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达差异。结果鼻咽癌组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率分别为76.25%、58.75%,高于对照组的36.25%、20.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。在未分化及病理学分期Ⅲ、Ⅳ期的鼻咽癌组织中,YAP蛋白阳性表达率高于分化型及病理学分期Ⅰ、Ⅱ期的鼻咽癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。在不同年龄、性别、病灶最大径、是否发生淋巴结转移、病理学分化程度、病理学分期的鼻咽癌组织中,碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论鼻咽癌组织中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达显著上调,其中YAP蛋白表达与肿瘤的发生发展关系密切。

建立基于miniSOG标签的光镜-电镜关联方法观察腺病毒Ⅸ蛋白的亚细胞定位

目的 建立光镜-电镜关联方法观察腺病毒蛋白Ⅸ的细胞内定位.方法 miniSOG是新发现的能够被荧光显微镜和电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆腺病毒结构蛋白Ⅸ与miniSOG的融合基因ⅨSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;通过荧光显微镜确定ⅨSOG蛋白表达的细胞,之后对转染细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片,用电镜观察细胞内ⅨSOG融合蛋白的表达及分布情况.结果 在蓝光激发下,miniSOG能够发射绿色荧光.定位选择光氧化形成嗜锇颗粒的ⅨSOG表达细胞进行电镜观察,结果显示Ⅸ蛋白在细胞核内多个区域形成点状聚集或包涵体.结论 建立了依赖miniSOG标签的的光镜-电镜关联方法,该方法可用于病毒蛋白细胞内定位研究.

成肌细胞介导的hF Ⅸ蛋白在小鼠体内的持续表达

目的：以小鼠C2C12成肌细胞为对象开展血友病乙基因治疗研究。方法：首先将构建好的带有MCK增强手和hCMV启动子的反转录病毒载体G1NaMCⅨ转染PA317细胞，并用其上情感染C2C12细胞，所得克隆细胞在离体分别进行了Southern、Northern、Western鉴定。进一步用带有hFⅨcDNA的C2C12细胞进行C3H小鼠活体表达研究。结果：hFⅨ活体表达量与细胞注射数量、细胞离体表达量呈正相关，使用免疫抑制剂可提高hFⅨ活体表达量并延长表达时间；较长时间间隔后进行重复注射亦可延长hFⅨ表达时间。结论：同种异体成肌细胞存在免疫排斥现象，较长时间间隔重复注射可提高移植细胞存活率，从而有助于实现成肌细胞介导的血友病乙基因治疗。

犬Ⅰ型腺病毒Ⅸ蛋白的生物信息学分析

为了探究犬Ⅰ型腺病毒(CAdV-1)Ⅸ蛋白的理化性质、空间结构与抗原位点,试验以中国农业科学院特产研究所宠物生物制品研发团队实验室分离毒株的Ⅸ蛋白氨基酸序列为研究对象,采用生物信息学方法,利用ProtParam tool、NetPhos 3.1 Server、TMHMM、PSIPRED、SOPMA、Phyre 2和IEDB等在线网站对Ⅸ蛋白的理化性质、磷酸化位点、糖基化位点、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原决定簇进行预测。结果表明:Ⅸ蛋白含有71个氨基酸,平均吸水系数为-0.399,等电点为9.86。α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占16.90%、35.21%、9.85%和38.03%。Ⅸ蛋白不存在跨膜区和信号肽,存在2个潜在蛋白质抗原决定簇、5个蛋白质磷酸化位点,潜在B细胞抗原决定簇为18~31位。说明本试验初步预测分析得到CAdV-1Ⅸ蛋白的理化性质和抗原决定簇,可为CAdV-1Ⅸ蛋白的分离、提纯提供参考依据,同时为进一步研制基于Ⅸ蛋白的亚单位疫苗提供前期基础。

红色荧光蛋白遗传标记腺病毒衣壳蛋白pⅨ的实验研究

采用在细菌Bj5183中同源重组的方法成功构建了红色荧光蛋白mCherry标记pⅨ蛋白的腺病毒质粒载体.将PacⅠ线性化的腺病毒质粒载体转染HEK293细胞7～10d后获得病毒裂解液,然后将其在体外进一步扩增并经CsCl密度梯度离心纯化后获得mCherry标记腺病毒pⅨ蛋白的病毒颗粒.在采用荧光显微镜检测荧光标记的病毒颗粒之后,将其加入A549细胞中,并在不同时间点追踪观察荧光标记的病毒颗粒在细胞内的定位.结果表明,在荧光显微镜下观察到病毒颗粒的红色荧光;在病毒与细胞孵育过程中,随着荧光标记病毒与A549细胞孵育时间的延长,病毒颗粒逐渐向细胞核周围聚集.

溃疡性结肠炎患者血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物与疾病严重程度、血小板激活的相关性

目的探索溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ(glycoproteinⅠb/Ⅸ/Ⅴ,GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)复合物与疾病严重程度、血小板激活的关系。方法选取了54例活动期UC患者和35名健康志愿者,采用美国胃肠病学会制订的临床指南对活动期UC患者的疾病严重程度进行分级。用比浊法检测UC患者和志愿者血小板最大聚集率(maximum agglutination rate,MAR)。采用流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物、血小板激活标志物血小板α颗粒膜糖蛋白(CD62P)和血小板表面纤维蛋白原受体(PAC-Ⅰ)的水平。结果活动期UC患者血小板MAR、CD62P和PAC-Ⅰ的阳性表达率较正常对照组明显升高,而GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的表达显著降低。在轻、中以及重度活动期UC患者中,血小板MAR、GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的表达、CD62P和PAC-Ⅰ的阳性表达率差异具有统计学意义。相关性分析显示血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的表达与血小板激活指标MAR、CD62P、PAC-Ⅰ呈负相关。结论血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物与血小板激活相关,可能在UC的发展中起作用并反映UC严重程度。

溃疡性结肠炎患者血浆P-选择素、血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物与疾病活动性的关系

目的探索溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者血浆P-选择素(P-selectin)、血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物与疾病活动性的关系。方法选择28例UC活动期、16例UC缓解期患者和26例健康志愿者,采用ELISA法检测血浆P-selectin,比浊法检测血小板最大聚集率(MAR),并采用流式细胞仪检测GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物。结果活动期UC患者血浆P-selectin、血小板MAR较缓解期患者及健康者明显升高(P<0.01或P<0.05),而GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的表达显著降低(P<0.01或P<0.05)。结论溃疡性结肠炎患者存在血小板激活,血浆P-selectin和GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物作为血小板激活的标志物,与疾病的活动程度相关,可以作为UC活动期的指标。

凝血因子Ⅸ/凝血因子Ⅹ结合蛋白家族的研究进展

凝血因子Ⅸ /Ⅹ结合蛋白家族是近来发现的C型动物凝集素超家族中一个亚家族 .它们存在于蝰科蛇毒中 ,不具有酶活性 ,通过与凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合来延长凝血时间 .在钙离子存在下结合在凝血因子Ⅸ /Ⅹ分子中γ 羧基谷氨酸区域 .它们彼此之间具有很高的序列同源性 ,都是由两条同源的肽链通过一对二硫键相连 .两条肽链都具有C型糖识别区的二硫键构型 ,各含一个钙离子结合位点 .其中habu凝血因子Ⅸ /Ⅹ结合蛋白的晶体结构已经测定 ,除掉相互交叠的中心环外 。

人体血清中原卟啉Ⅸ自体荧光光谱研究

通过对人体血清样品和模拟人体生理条件下原卟啉Ⅸ和牛血清白蛋白混合溶液的荧光光谱测定和分析,表明人体血清中原卟啉Ⅸ的自体荧光光谱主要来自于原卟啉Ⅸ和血清白蛋白的结合形式。此外,还考察了血清白蛋白和原卟啉Ⅸ对原卟啉Ⅸ荧光发射峰的影响。和不含有白蛋白的原卟啉Ⅸ溶液相比较,白蛋白不但使原卟啉Ⅸ产生的荧光峰发生红移,而且具有很强的增敏效应。在白蛋白存在条件下,当原卟啉Ⅸ浓度值小于0.8×10-5mol·L-1时,随着它的浓度增加,原卟啉Ⅸ的荧光发射峰稍有红移;而当原卟啉Ⅸ浓度值大于0.8×10-5mol·L-1时,其荧光发射波长几乎不随原卟啉Ⅸ浓度而变化。

益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物及GPⅠbα表达的影响

目的观察益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者凝血酶受体血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物及其组分GPⅠbα的表达的影响来探讨其配伍规律。方法68例出血性血小板病患者及32例健康人静脉血在静息状态及体外加益气活血方及其拆方中药孵育后,采用流式细胞术检测血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα的表达。结果静息状态时,患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα的表达明显低于健康人;益气活血方及其部分拆方组能使患者凝血酶受体GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα恢复至正常水平;而单味中药组作用不明显;方中的主药黄芪与当归配伍为用,可促进血小板膜糖蛋白的表达。结论益气活血全方及其部分拆方组在受体蛋白水平上调节GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα的表达,是其治疗出血性血小板病的疗效机制之一。

冠心病患者血清瘦素水平变化及其与血小板膜GPⅠ b的关系

目的:探讨冠心病患者血清瘦素水平变化及其与血小板膜GPⅠb的关系。方法:选择经冠状动脉造影确诊的冠心病患者50例(冠心病组)、非冠心病患者30例作为对照(对照组)。应用全血流式细胞术检测血小板膜GPⅠb阳性百分率及平均荧光强度,酶联免疫吸附法检测血清瘦素水平。结果:冠心病组血小板膜GPⅠb阳性百分率及平均荧光强度均低于对照组(P<0.05);校正收缩压、体质量指数(BMI)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖、2h血糖、空腹胰岛素水平及定量胰岛素敏感指数,冠心病组血清瘦素水平高于对照组(P<0.05);单因素相关分析表明冠心病患者血清瘦素水平与血小板膜GPⅠb平均荧光强度呈负相关(P<0.05);多元逐步回归分析显示冠心病患者血清瘦素水平与血小板膜GPⅠb平均荧光强度呈独立负相关(P<0.05);Logistic回归分析显示血清瘦素与冠心病发病呈独立正相关(P<0.05)。结论:冠心病患者表现为高瘦素血症,血清瘦素水平增高可能影响血小板活化,高瘦素血症可能在冠心病的发病中具有重要的作用。

CD42b、CD62p、hsCRP和Hcy与AMI患者冠脉病变程度的关系及对预后的预测价值

目的:分析CD42b、CD62p、hsCRP和Hcy与AMI患者冠脉病变程度的关系及对预后的预测价值。方法:根据SYNTAX评分,242例行PCI的AMI患者被分为低分组(65例,≤20分)、中分组(106例,21分~31分)和高分组(71例,≥32分),比较各组血浆CD42b、CD62p、hsCRP和Hcy水平。Pearson相关分析上述指标与SYNTAX评分的相关性;比较各组MACCE发生率;以ROC曲线分析上述指标对MACCE的预测价值。结果:与低分组比较,中分、高分组血浆CD42b水平[(87.71±5.94)比(68.93±3.45)比(55.54±4.31)]显著降低,血浆CD62p[(21.63±3.29)比(27.47±3.01)比(37.81±3.78)]和Hcy[(13.14±1.60)μmol/L比(17.31±1.93)μmol/L比(22.30±2.73)μmol/L]水平显著升高,P均=0.001。Pearson相关分析显示血浆CD42b水平与AMI患者SYNTAX评分显著负相关(r=-0.885,P=0.001),血浆CD62p和Hcy水平与SYNTAX评分显著正相关(r=0.799,0.801,P均=0.001)。与低分、中分组比较,高分组MACCE发生率(9.23%、18.87%比35.21%)显著升高,P=0.001,0.014。ROC曲线显示血浆CD42b、CD62p和Hcy预测AMI患者发生MACCE的最佳截断值分别为69.72、28.33和20.77μmol/L,灵敏度分别为64.7%、73.1%和75.2%,特异度分别为69.3%、80.5%和63.8%。结论:血浆CD42b水平和AMI患者SYNTAX评分显著负相关,CD62p及Hcy水平与SYNTAX评分显著正相关,且对预后MACCE事件有一定的预测价值。

通阳中药葱白提取物抑制低压低氧诱导促凝血反应的机制研究

目的研究通阳中药葱白提取物(AYMOE)对低压低氧诱导的血小板激活和促凝状态的影响。方法将42只成年雄性SD大鼠随机分为对照组(暴露于常压常氧环境)、低压低氧组(Hyp组,暴露于低压低氧环境)、Hyp+AYMOE-100组(暴露于低压低氧环境并口服AYMOE 100 mg/kg)、Hyp+AYMOE-200组(暴露于低压低氧环境并口服AYMOE 200 mg/kg)、Hyp+AYMOE-300组(暴露于低压低氧环境并口服AYMOE 300 mg/kg)、Hyp+anti-CD42c组(暴露于低压低氧环境并尾静脉注射antiCD42c 5 mg/kg)、Hyp+AYMOE-200+rh Lyn组[暴露于低压低氧环境并口服AYMOE 200 mg/kg联合尾静脉注射重组人酪氨酸蛋白激酶Lyn(rh Lyn) 4.8 mg/kg],每组6只。低压低氧暴露7 d后,ELISA检测各组大鼠血清血栓素A2(TXA2)以及血小板激活因子(PAF)含量,检测大鼠血小板的凝集率,HE染色观察大鼠肺组织病理变化,Western blot检测GPIb-Ⅸ-Ⅴ、Lyn、磷酸化的Lyn(p-Lyn)的表达。结果与对照组比较,暴露于低压低氧的各组大鼠血清TXA2、PAF水平及血小板凝集率升高,GPIb-Ⅸ-Ⅴ、Lyn、p-Lyn蛋白表达上调(P <0.05)。与Hyp组相比,Hyp+AYMOE-100组、Hyp+AYMOE-200组、Hyp+AYMOE-300组的血小板凝集率、血清TXA2、PAF的水平降低,差异均有统计学意义(P <0.05),其中以Hyp+AYMOE-200组抑制效果最明显(P <0.05)。与对照组比较,Hyp组大鼠因低氧而发生血管堵塞,肺静脉血管腔空间狭小;与Hyp组相比,Hyp+AYMOE-200组大鼠肺静脉血管栓塞明显缓解。与Hyp组相比,Hyp+anti-CD42c组和Hyp+AYMOE-200组GPIb-Ⅸ-Ⅴ、Lyn、p-Lyn蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P <0.05)。与Hyp+AYMOE-200组比较,Hyp+AYMOE-200+rh Lyn组血小板凝集率、血清TXA2和PAF水平均较高,Lyn和p-Lyn蛋白表达均增加,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论 AYMOE可通过抑制GPIb-Ⅸ-Ⅴ和Lyn减少低压低氧诱导的血小板激活并改善促凝状态。

血管性血友病因子和血小板表面受体突变的数据库构建及数据分析

背景:血管性血友病因子和血小板表面受体之间的相互作用在血小板黏附、传播、聚集等血栓形成过程中起到关键作用。目前关于血管性血友病因子突变信息的数据库并不完善且血小板表面受体相关的数据库仍未构建。目的:致力于构建血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα相关突变的数据库,以利于相关领域的研究人员快速查找到该分子对的重要突变信息。方法:以数据库Uniprot、VWFdb及文献报道的突变信息为数据源,采用MySQL和Apache为后台数据库和服务器,运用PHP语言开发血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα突变数据库。结果与结论:收集了341条血管性血友病因子,13条血小板糖蛋白Ibα的野生或者突变序列数据,并人工构建A1结构域的虚拟突变3 920条,建立了包括背景介绍、相关病理图册和资料下载等登录页面,初步实现了数据检索、突变位点分析以及虚拟突变位点信息等相关功能。该数据库较全面搜集及分析血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα的数据信息,有利于研究人员对血管性血友病因子和血小板糖蛋白Ibα相关信息的查询,有助于新型抗血栓药物的研发,进一步提高临床诊断和治疗水平。

体外血小板流动腔研究方法的建立和应用

目的建立模拟体内血液流动环境下,实时观察、研究血小板与血管表面血管性假性血友病因子(vWF)相互作用的模型。方法利用包被vWF的细玻璃管模拟血管,分别采用负压装置、蠕动泵和恒流注射泵产生不同流态和精确剪切率的流体环境,结合倒置显微镜和电荷耦合器件图像传感器(CCD,Charge-coupleddevice)实时观察和记录血小板或细胞在流体作用下的一系列反应。结果血小板和转染了血小板糖蛋白Ib-Ⅸ的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO),在不同流态下都可与玻璃管壁上的vWF相互作用,从而介导血小板或CHO细胞与玻璃管壁的瞬时结合(滚动),并最终牢固结合在玻璃管壁上。结论本研究方法可以在精确剪切率和不同流态的流体环境条件下,实时地观察、记录血小板与vWF相互作用的情况,为血小板各种生理功能的研究以及相关药物的研究应用创造条件。

子宫内膜异位症异位结节和异位囊肿病因的研究

比较基质金属蛋白酶Ⅸ型和Ⅵ型胶原在异位结节和异位囊肿的表达 ,探讨异位结节和异位囊肿的发病机制。方法 :收集近一年归档的子宫内膜异位症蜡块 ,采用免疫组织化学的方法 (SP法 )测定基质金属蛋白酶Ⅸ和Ⅵ型胶原在异位结节和异位囊肿的表达。结果 :异位囊肿较异位病灶显示了对基质金属蛋白酶Ⅸ的低表达 ( 36.7% ) ,对Ⅵ型胶原的高表达 ( 73.3% ) ,异位结节显示了对基质金属蛋白酶Ⅸ的高表达 ( 83.3% ) ,对Ⅵ型胶原的低表达 ( 6% ) ,两组间比较P <0 .0 1 ,具有显著性差异。结论 :异位囊肿较异位病灶显示了对基质金属蛋白酶Ⅸ的低表达 ,对Ⅵ型胶原的高表达 ,在子宫内膜异位症的发病机制中 。

双抗体夹心ELISA法测定人凝血因子IX蛋白

用双抗体夹心ELISA法测定人凝血因子IX蛋白。在转入了外源人凝血因子IX基因的CHO细胞和HSF细胞的培养液中均测得一定量的IX因子蛋白,其量相当于正常人血浆IX因子蛋白的0.89%～3.81%,而对照细胞均为阴性结果。对一例血友病B患者(IX:C<0.1%)的分析结果表明,其血浆中含有的IX因子蛋白量相当于正常人的52.3%,因而将此病例归属于血友病B^R型。本法灵敏度高、特异性强、重复性好,可与一期法相互补充,应用于临床血友病B的诊断、分类、家系分析及携带者的检出。

血管性血友病因子-糖蛋白Ⅰb轴与缺血性卒中

由于传统再灌注治疗的时间窗较窄且存在再灌注损伤风险,故而从病理生理学角度对缺血性卒中的发病机制展开研究,探索减轻再灌注损伤的方法。文章阐述了血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)与血小板糖蛋白(platelet glycoprotein,GP)Ⅰb的功能及其在止血、血栓形成和炎症中的作用,认为通过药物阻断vWF-GPⅠb的相互作用可能有助于缺血性卒中的治疗,并进一步讨论了其在缺血性卒中和缺血性脑损伤中的重要临床意义。

前瞻性评价单克隆抗体俘获血小板抗原技术对免疫性血小板减少症的诊断价值

目的 评价单克隆抗体俘获血小板抗原技术（MAIPA）对免疫性血小板减少症（ITP）的诊断价值,以及对免疫性和非免疫性血小板减少的鉴别诊断价值.方法 以来自14家医院的321例血小板减少患者为研究对象,男118例,女203例,应用改良MAIPA试验双盲法检测患者血小板膜糖蛋白特异性自身抗体（抗-GPⅡb/Ⅲa和抗-GP Ⅰ b/Ⅸ）,客观评价该试验在ITP诊断中的敏感性和特异性,了解ITP患者血小板特异性抗体浓度与血小板数量的相关性以及地塞米松治疗后抗体浓度的变化.结果 抗-GPⅡb/Ⅲa、抗-GP Ⅰ b/Ⅸ、抗-GPⅡb/Ⅲa联合抗-GP Ⅰ b/Ⅸ诊断ITP的敏感性分别为39.75%、32.64%、55.23%,特异性分别为97.56%、93.94%、92.68%,阳性预测值分别为97.94%、93.98%、95.65%,阴性预测值分别为35.71%、32.35%、41.53%,总有效率分别为54.51%、48.29%、64.80%;ITP患者血小板特异性抗体阳性率显著高于非免疫性血小板减少患者;抗体阳性患者的血小板数量显著低于阴性患者,ITP患者血小板特异性抗体水平[吸光度（A）值]与血小板数量呈负相关;激素治疗有效的ITP患者抗-GPⅡb/Ⅲa或（和）抗-GP Ⅰ b/Ⅸ转阴或抗体水平降低.结论 MAIPA试验对ITP具有较高的诊断价值,对ITP患者的疗效也具有指导意义,可作为IFP和非免疫性血小板减少的鉴别诊断依据.