甘蔗△^1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析

△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶。应用同源性克隆结合RACE技术获得甘蔗P5CS基因cDNA全长序列2714bp,其中5′端非编码区为226bp,3′端非编码区340bp,poly(A)上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA;开放读码框为2148bp编码715个氨基酸,含双功能域;其编码的蛋白分子量为77.7ku,等电点为6.47。序列比对分析结果表明,P5CS基因的4个主要功能区(domain)中亮氨酸功能区(Leucinedomain)相对不保守,其它功能区均较为保守。对17个物种的P5CS基因进行聚类分析,结果与公认的生物学分类及进化关系吻合。对甘蔗P5CS在根、茎、叶的表达进行实时PCR分析,结果表明,该基因在茎、叶表达量相近,但在根的表达量极低。

吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌组织中表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察

目的 观察吡咯啉-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxylate synthase,P5CS)在肝细胞癌(Hepatocellular car-cinoma,HCC)组织中的表达变化及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用。方法 (1)HCC及癌旁组织P5CS检测:选择10例HCC患者的癌组织及癌旁组织,采用免疫组化法检测HCC及癌旁组织P5CS蛋白;(2)P5CS对人肝癌细胞系Li-7、Huh-7铁死亡的调控作用观察:取对数生长期Li-7、Huh-7,用si ALDH18A1[乙醛脱氢酶家族18成员A1(AL-DH18A1)可编码P5CS蛋白]转染细胞,采用q RT-PCR法检测转染前后Li-7及Huh-7细胞脂质过氧化物合成相关基因ACSL4、LPCAT3、LOX-15,采用WESTERN Blotting法检测转染前后Li-7及Huh-7细胞铁死亡相关蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)。取转染前后Li-7及Huh-7细胞各分为2组,分别加入5μmol/L的铁死亡诱导剂Erastin、同体积DMSO,采用C11-BODIPY荧光探针检测各组细胞脂质过氧化物含量。取转染前、后Li-7及Huh-7细胞各分为2组,分别加入5μmol/L的GPX4靶向抑制剂RSL-3、5μmol/L的Erastin、同体积DMSO,采用C11-BODIPY荧光探针检测各组细胞脂质过氧化物含量。结果 HCC及癌旁组织P5CS蛋白相对表达量分别为6.80±2.10、0.40±0.20,二者比较,P<0.05。与转染前比较,转染后Li-7及Huh-7细胞SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低(P均<0.05)。与转染前比较,转染后加入Erastin、RSL-3的Li-7、Huh-7细胞脂质过氧化物含量均升高(P均<0.05)。与加入Erastin者比较,转染后加入RSL-3的Li-7、Huh-7细胞脂质过氧化物含量高、细胞活性低(P均<0.05)。结论 HCC组织中P5CS表达升高。P5CS可抑制Li-7及Huh-7细胞的铁死亡,P5CS可能通过抑制细胞GPX4表达,调控Li-7及Huh-7细胞的铁死亡。

玉米1-吡咯啉-5-羧酸合成酶在非生物胁迫下的表达分析

脯氨酸在植物渗透调节中起举足轻重的作用,1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶,为了研究玉米P5CS基因家族与玉米抗逆性的关系,对玉米幼苗进行了非生物胁迫(干旱、低温、盐胁迫)处理,利用半定量RT-PCR技术分析了ZMP5CS基因家族在不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,ZMP5CS基因家族中除ZM02G27230以外的基因不论地上部叶还是地下部根均被干旱胁迫诱导上调表达,但各成员之间其表达量最高点出现的时间不同;相同处理同一基因相同的处理时间点地上部与地下部基因表达量存在差异,在干旱胁迫下ZM08G14210的表达量最高,在盐胁迫下ZM08G31890的表达量最高,在低温胁迫下ZM06G25580的表达量最高,说明ZMP5CS基因家族表达受非生物胁迫的诱导。

阿魏酸结合吡咯啉-5-羧酸还原酶1抑制乳腺癌细胞增殖

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。天然产物因其结构多样、毒副作用低及作用机制独特等优势已然成为开发抗肿瘤药物的主要来源。以人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象,探索植物源多酚类物质阿魏酸(ferulic acid,FA)对乳腺癌细胞的影响。细胞存活实验和克隆形成实验表明,阿魏酸可以抑制MCF-7和4T1细胞的存活和增殖,且抑制效应具有浓度依赖性。通过Pull-down、银染和LC-MS-MS质谱鉴定分析发现,FA与蛋白质吡咯啉-5-羧酸还原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1)有直接相互作用。PYCR1体内能通过酶促反应催化脯氨酸代谢合成,发挥促进肿瘤生长和增殖的作用。使用Autodock Vina和PyMOL软件模拟分子对接,结果显示,FA与PYCR1的246位谷氨酸和251位精氨酸存在相互作用;通过酶活力检测证实,FA靶向结合PYCR1且以浓度依赖性的方式抑制其酶活性;通过分析人类肿瘤基因图谱(TCGA)发现,PYCR1在乳腺癌患者中的表达显著高于健康对照人群(P<0.0001),且高表达的PYCR1与临床不良预后高度相关。

吡咯啉-5-羧酸还原酶-1、增殖细胞核抗原和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3在膀胱尿路上皮癌中的表达及检测临床意义

目的:观察膀胱尿路上皮癌中吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)、增殖细胞核抗原(PCNA)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)的表达特征。方法:选择确诊为膀胱尿路上皮癌的患者63例作为观察组,选择经病理证实为正常膀胱黏膜的组织63例作为对照组,应用免疫组化法检测组织中PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达,分析PYCR1、PCNA和Caspase-3在观察组不同临床病理特征中的表达差异及与术后生存时间的相关性。结果:PYCR1和PCNA在观察组中的阳性率均明显高于对照组,Caspase-3在观察组中的阳性率明显低于对照组(均P<0.05);观察组中PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达与病变分级、浸润深度、脉管癌栓和是否伴鳞状分化密切相关(均P<0.05),而与性别、年龄、神经累犯无明显相关性(均P>0.05);PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达均与术后生存时间有关;观察组中PYCR1与PCNA具有正相关性,PYCR1与Caspase-3具有负相关性,而PCNA与Caspase-3无明显相关性。结论:膀胱尿路上皮癌中PYCR1和PCNA高表达、Caspase-3低表达均参与病变的形成和进展,联合检测PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达对判断预后有一定价值。PYCR1与增殖指标PCNA、凋亡指标Caspase-3均有一定关联性。

朝鲜碱茅Δ’-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆及表达分析

脯氨酸在提高植物抗逆性方面起着非常重要的作用。本研究以朝鲜碱茅茎叶组织提取的RNA为模板,根据已报道的P5CS基因同源序列设计引物,通过RT-PCR法扩增出1个P5CS的cDNA序列,全长2 158 bp,是一个完整开放阅读框,编码含716个氨基酸的蛋白,Genebank登陆号为:HQ637435。与其他植物P5CS基因进行同源性比对的结果显示,朝鲜碱茅P5CS基因的核苷酸和氨基酸序列与小麦的同源性最高。并对其信号肽、疏水性、跨膜结构、二级结构和主要功能域做了预测。半定量RT-PCR结果表明,PuP5CS基因在朝鲜碱茅的根部和叶片均有表达,但是根部的表达量较低,叶片中的表达量较高,在4种胁迫处理条件下,表达规律也不尽相同。

Δ’吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因在水稻上的荧光原位杂交(英文)

脯氨酸的积累与植物对干旱和盐胁迫的抗性有关。P5CS基因编码一个双功能酶 ,具有谷氨酸激酶和谷氨酸 -γ -半醛脱氨酶活性 ,催化脯氨酸合成过程中的前 2步反应。它是脯氨酸合成的限制因子。用生物素标记的荧光原位杂交技术 ,以蛾豆 (Vignaaconitifolia)中克隆到的P5CS基因作探针对水稻进行物理作图。该探针定位于水稻第 9染色体的短臂近端点处 ,信号点距着丝粒的相对距离为 ( 5 1 .79± 1 .2 4 ) %。

盐地碱蓬Δ~1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶基因(SsP5CS)的克隆及表达特性

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了Δ1 -二氢吡咯 -5 -羧酸合成酶基因的cDNA片段 (S .salsaΔ1 -pyrroline -5 -carboxylatesynthasegene,Ssp5CS) .Southern杂交表明SsP5CS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern杂交结果表明 ,不同盐处理 (4 0 0mmol/LNaCl)时间下SsP5CS在盐地碱蓬叶中的表达量明显增加 ;同时盐胁迫条件下盐地碱蓬叶中的脯氨酸含量与对照相比显著的增加 ,并且其渗透调节能力也逐渐增强 .

吡咯啉-5-羧酸还原酶1在膀胱癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨吡咯啉-5-羧酸还原酶1(pyrroline 5 carboxylate reductase 1,PYCR1)在膀胱癌组织中的表达及其临床意义。方法通过对TCGA数据库分析并采用实时定量免疫荧光PCR(qRT PCR)和免疫组化S P法,研究PYCR1 mRNA和蛋白在膀胱癌和癌旁组织中的表达情况,并分析其与临床病理资料的相关性。结果TCGA数据库表明膀胱癌组织中PYCR1的mRNA表达水平显著高于癌旁组织[(9.984±1.614)vs.(7.529±1.087),P<0.001],并且发现PYCR1高表达与年龄(χ^2=9.064,P=0.003)、病理分级(χ^2=18.133,P=0.000)、N分期(χ^2=13.439,P<0.001)、T分期(χ^2=4.681,P=0.03)、M分期(χ^2=5.569,P=0.018)和临床分期(χ^2=14.303,P<0.001)密切相关。qRT PCR和免疫组化S P结果证实PYCR1 mRNA和蛋白在膀胱癌中高于癌旁组织,差异具有统计学意义(均P<0.05),PYCR1 mRNA和蛋白阳性表达与膀胱癌临床分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。结论PYCR1在膀胱癌中呈高表达,并与膀胱癌患者的临床病理特征有一定的相关性,提示PYCR1参与了膀胱癌的发生、发展。

玉米Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因家族生物信息学分析

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase,P5CS)是脯氨酸代谢途径的关键酶,对植物抵抗逆境胁迫起至关重要的作用。为了探索P5CS在玉米对逆境胁迫的响应,本文对5个玉米P5CS基因家族蛋白的基本理化性质、二级结构预测、亚细胞定位、基因结构、进化关系及保守基序等方面进行初步生物信息分析。结果显示,5个玉米P5CS蛋白中有3个偏酸性,1个显中性,1个偏碱性;2个以无规则卷曲为主要构成元件,3个P5CS蛋白主要以α白螺旋为主要构成元件;不稳定指数分析发现,4个P5CS蛋白为稳定蛋白;疏水性分析表明,所有的P5CS蛋白为亲水性蛋白;玉米P5CS家族内含子最少含有4个内含子,最多的含有19个内含子;亚细胞定位分析表明,P5CS均蛋白定位于细胞基质;进化分析表明,P5CS家族分3个亚家族。

吡咯啉-5-羧酸还原酶-1在恶性肿瘤中的研究进展

吡咯啉-5-羧酸还原酶-1(Pyrroline-5-Carboxylate Reductase-1,PYCR1)是一种线粒体酶,其基因突变可导致人类皮肤松弛症。近年研究证明PYCR1能通过影响脯氨酸代谢发挥促进肿瘤生长增殖的作用。PYCR1在多种恶性肿瘤中高表达,且其表达水平与患者预后负相关。因此,PYCR1可能可以作为一种新型标志物,应用于肿瘤的诊断和预后,并有望成为肿瘤治疗的新靶点。

N-氨甲酰谷氨酸的生理功能及其应用技术

本文综述了改善母猪繁殖性能的特殊营养调控剂精氨酸的替代物——N-氨甲酰谷氨酸的生理功能及其应用技术,特别阐明了NCG替代Arg在生产中的应用优势,对改善繁殖母猪生产性能具有重要的指导意义。

拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝增强耐盐性分析

【目的】分析转拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因羽衣甘蓝的耐盐性,为获得较强的耐盐性羽衣甘蓝品种及其抗逆育种提供理论依据。【方法】将拟南芥P5CS1基因(AtP5CS1)经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植物中,在盐胁迫下,分别检测转基因植株与野生型植株的AtP5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干质量和鲜质量、叶片相对水含量、叶片电导率和整株存活率。【结果】在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表达,与对照相比,转基因株系Y1、Y2的主根和最长侧根长度较长,侧根数目较多,整株干质量和鲜质量较重;而且相对水含量显著高于对照植株(P<0.05,下同),脯氨酸含量及存活率均极显著高于对照植株(P<0.01),叶片相对电导率显著低于对照植株。【结论】转AtP5CS1基因植株的耐盐表型优于对照,即AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性。

转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性

为提高羽衣甘蓝的抗寒性,本试验将拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,检测转基因株系在4℃低温胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、叶绿素荧光参数(Fv/Fm)和植株存活率。结果显示,在4℃低温胁迫下,转基因植株的P5CS1基因的mRNA过量表达,脯氨酸含量、可溶性糖含量、Fv/Fm和植株存活率均显著高于野生型对照(P<0.05),但丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型对照(P<0.05)。表明拟南芥P5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的抗寒性。

脯氨酸累积与其合成关键酶活性的关系

假俭草是暖季型的主要成坪草种.5叶期的假俭草幼苗在20%PEG6000(-1.63Mpa)模拟的水分胁迫条件下,脯氨酸作为一种重要的渗透保护物质在24h出现明显增高,而控制脯氨酸合成的谷氨酸途径中的关键酶 1-吡咯啉-5-羧酸合成酶的活性下降,而鸟氨酸途径中的关键酶:δ-鸟氨酸转氨酶的活性却显著增高.S-鸟氨酸转氨酶的活性与脯氨酸的累积有显著的正相关(r=0.96),而 1-吡咯啉-5-羧酸合成酶的活性与脯氨酸的累积呈负相关(r=-0.93).

PYCR1对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨人吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)对胃癌细胞AGS增殖和侵袭的影响。方法:人胃癌细胞AGS转染敲减和过表达PYCR1的质粒,设置3种敲减序列,qRT-PCR和Western Blot检测PYCR1 mRNA和蛋白表达以验证敲减效率,并以敲减效率最好的进行后续实验,AGS细胞分为si-NC组、si-PYCR1组、pcDNA组、PYCR1组,采用CCK8检测各组不同时间点细胞活力,采用伤口愈合实验检测各组迁移能力,采用Transwell实验检测各组迁移和侵袭能力。结果:qRT-PCR和Western Blot检测结果发现,三种敲减序列PYCR1 mRNA和PYCR1蛋白均低于si-NC组,过表达PYCR1组PYCR1 mRNA和PYCR1蛋白高于pcDNA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CCK8检测各组细胞增殖活力,结果发现,si-PYCR1组48 h、72 h和96 h细胞活力显著低于si-NC组相同时间点,而PYCR1组48 h、72 h和96 h细胞活力高于pcDNA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。伤口愈合实验检测各组细胞迁移能力,以48 h/0 h划痕宽度进行定量分析,结果发现,si-PYCR1组48 h/0 h划痕宽度高于si-NC组,PYCR1组48 h/0 h划痕宽度低于pcDNA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力,以迁移和侵袭细胞数进行定量分析,结果发现,si-PYCR1组迁移和侵袭细胞数少于si-NC组,PYCR1组迁移和侵袭细胞数多于pc DNA组,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论:PYCR1可以促进胃癌细胞增殖、迁移及侵袭,可能是胃癌发病机制的关键分子和治疗的新靶点。

木薯及其他植物P5CS基因进化及表达分析

该研究采用生物信息学的方法,从木薯等31个已完成基因组测序的植物中,共鉴定出84个吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因,并对其进行系统发育分析。结果表明:(1)P5CS在内含子长度上差别较大,而在氨基酸长度、外显子数目、等电点和分子量上差别不大。(2)由于发生基因重复,在大多数单子叶和双子叶植物中都有2个P5CS,而且在单子叶和双子叶植物中均发现P5CS1基因聚类在一组,而P5CS2基因聚类在另一组,支持P5CS1和P5CS2基因是独立起源,且该重复事件发生在单子叶和双子叶植物分化之前。(3)在某些植物(如蒺藜苜蓿、大豆等)中存在3~7个P5CS基因,表明在单子叶和双子叶植物分化之后P5CS基因又发生了多次重复事件,并将它们归纳为4种进化模式。(4)木薯中有2个P5CS基因,表达分析显示,MeP5CS1和MeP5CS2在叶片、叶柄、茎、须根和储藏根中均可检测到,其中MeP5CS1在叶片中表达较高,而MeP5CS2在茎和储藏根中表达较高。(5)干旱胁迫下,MeP5CS1仅在第一片完全展开叶中被显著诱导,而MeP5CS2在第一片完全展开叶和老叶中均能被显著诱导;低温胁迫下,MeP5CS1和MeP5CS2在不同组织中均能被显著诱导,但具有不同的表达模式。研究表明,木薯的MeP5CS1和MeP5CS2基因在转录水平受到干旱、低温等非生物胁迫的调控。

盐胁迫对菊苣幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响

以菊苣(Cichoriumintybus L.)为材料,研究不同浓度NaCl处理对菊苣幼苗体内脯氨酸代谢的影响,以期揭示菊苣中脯氨酸代谢的基本规律。结果表明:随着处理浓度的增加,菊苣中鸟氨酸δ-氨基转移酶(δ-OAT)活性呈上升趋势;吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性呈现先升后降的趋势;脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性呈下降趋势;而脯氨酸含量则显著上升(P<0.05),但高浓度长时间处理后略有降低。研究表明,NaCl胁迫下谷氨酸(Glu)途径和鸟氨酸(Orn)途径对菊苣中脯氨酸的积累均有贡献,低浓度胁迫时P5CS起关键作用的Glu途径占主导地位,高浓度胁迫时δ-OAT起关键作用的Orn途径占主导地位。

水稻脯氨酸代谢关键酶对水分胁迫的响应

以二叶期水稻幼苗为试验材料,研究其在15%PEG6000模拟的水分胁迫下脯氨酸积累及代谢关键酶活性变化,结果表明:叶片和根系中脯氨酸含量在胁迫后快速积累,胁迫24 h达到最大值,随后逐渐降低;控制脯氨酸合成的关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)活性都呈现先升后降的变化趋势,而控制脯氨酸降解的关键酶脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性呈现先降后升的变化趋势。

大麦幼苗叶片脯氨酸代谢及其与耐盐性的关系

在 0～ 30 0mmol·L-1NaCl浓度范围内 ,大麦叶片内催化脯氨酸 (Pro)合成的关键酶吡咯啉 5 羧酸合成酶 (P5CS)、精氨酸酶、鸟氨酸转氨酶 (OAT)和谷氨酸脱氢酶 (GDH)的活性均明显提高 ,脯氨酸脱氢酶 (ProDH)活性略有下降 ,与之相对应 ,叶片内Pro含量上升 4～ 11倍。 2 0 0mmol·L-1NaCl以下浓度处理 ,Pro合成主要是通过谷氨酸 (Glu)途径(关键酶为P5CS) ,2 0 0mmol·L-1以上NaCl胁迫下鸟氨酸 (Orn)途径 (关键酶为OAT)受激。ΔGR/ΔNaCl (每提高单位NaCl浓度时植株生长速率的下降值 )可以代表植物的耐盐性 ,植物耐盐性越强该比值越小。统计表明 ,大麦ΔGR/ΔNaCl与叶片ΔPro/(Arg +Glu)·Δ1/NaCl (每提高单位NaCl浓度时叶片内Pro/(Arg +Glu)的上升值 )呈极显著负相关关系 ,与一定浓度NaCl处理下叶片K+ /Na+ 呈极显著负相关关系 ,说明盐处理后Arg和Glu向Pro的转化有利于大麦耐盐性的提高。在 10 0mmol·L-1NaCl处理时 ,ΔGR/ΔNaCl值与Pro对植株渗透势的贡献呈显著负相关 ,说明盐胁迫下Pro积累具有渗透保护剂的功能。