3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的融合表达及纯化

3-甾酮-Δ1-脱氢酶是甾体母核降解的关键酶,能催化3-甾酮化合物在C1,2位处脱氢,提高原有底物的生物活性。利用表达载体pET-30a,实现了简单节杆菌3-甾酮-Δ1-脱氢酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。利用SDS-PAGE分别对超声破碎后的上清和沉淀进行分析,并用分光光度法检测酶的活力。结果表明,表达出的蛋白主要以无活性的包涵体形式存在,利用Ni离子螯合层析的方法纯化融合蛋白,复性后的酶活比简单节杆菌提高了近10倍。

分支杆菌Mycobacterium fortuitum HCCB003 Δ~1-脱氢酶的初步研究

研究了分支杆菌MycobacteriumfortuitumHCCB 0 0 3无细胞PBS抽提液对底物 4AD和ADD的转化 ,发现该菌株中同时存在Δ1 脱氢酶和Δ1 还原酶 ,但前者的催化活性远高于后者。同时研究了不同温度及有关金属离子对Δ1 脱氢酶活力的影响 ,发现 2 8℃为该酶的最适温度 ,以及一定浓度的Fe2 + 、Mn2 + 、Zn2 + 、和Ca2 + 对该酶具有激活作用。

表达3-甾酮-△^(1)-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。

简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究

目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质。方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化。结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E.coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27%;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y。突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致。结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础。