RNAi干扰油菜Δ^(12)-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNA i介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶(FAD2)干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(-βActin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明,转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNA i干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNA i干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。

卷枝毛霉Δ12-脱饱和酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

Δ12-脱饱和酶是亚油酸合成的关键酶,为提高Δ12-脱饱和酶的活性,本研究利用RT-PCR对Mucor sp.EIM-10的Δ12-脱饱和酶c DNA进行克隆,并导入p YES2.0质粒中,构建重组表达载体。运用醋酸锂转化法将重组质粒导入酿酒酵母,成功构建p YMD12酿酒酵母表达系统。为了进一步提高Δ12-脱饱和酶的表达水平,用GAP启动子替代p YES2.0质粒自带的启动子,成功构建p YGAPMD12重组菌。最终产物经GC-MS检测显示,p YGAPMD12重组菌转化C18∶1的转化率为69.172%,比p YMD12重组菌提高32.771%。本文为进一步提高Δ12-脱饱和酶的表达水平提供参考依据。

Δ12/Δ15脂肪酸脱饱和酶在多不饱和脂肪酸生产中的应用研究进展

Δ12/Δ15脂肪酸脱饱和酶(FADS12/15)广泛存在于植物、动物和微生物中,是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)合成的关键酶,在其生产中发挥着重要作用。PUFAs具有广泛的益生功能,但是由于人体内缺乏FADS12/15,无法合成亚油酸和α-亚麻酸,因此必须通过食物摄入来补充。此外,人体对其他PUFAs的需求也很高,迫切需要开发优质的PUFAs生产者。微生物是脂肪酸生产的潜在资源,通过FADS12/15基因工程改造可有效提高ω-3和ω-6 PUFAs的产量,从而为人类提供优质的生物脂质资源。作者综述了FADS12/15参与的脂肪酸合成途径及其催化机理,以及FADS12/15基因过表达体系和基因工程微生物种类,总结了FADS12/15同源或异源表达生产PUFAs的研究现状,旨在为FADS12/15基因工程研究和PUFAs的高效生产提供参考。

微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor.pusillus)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53%,微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。此试验为进一步研究Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。

卷枝毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因的敲除及功能研究

γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)是人体所必需且具有多种生理功能的一种重要多不饱和脂肪酸。研究表明,卷枝毛霉等GLA生产菌株中△6-脂肪酸脱饱和酶(△6-Fatty acid desaturase,FAD6)是合成γ-亚麻酸的关键和限速酶,然而GLA是否惟一通过△6-脂肪酸脱饱和酶途径合成则目前还没有报道。作者以卷枝毛霉Mucor circinelloides EIM10 sp.为研究对象,以其FAD6基因的5'端启动子和3'端终止子为同源臂,潮霉素B抗性基因为筛选标记,构建了M.circinelloides EIM10 sp.△6-脂肪酸脱饱和酶FAD6的敲除载体p UMCD6-Hm B,转化进入制备好的原生质体中成功地敲除了FAD6基因,发现FAD6基因缺陷菌株GLA质量浓度比野生型对照菌株降低了50%以上,但GLA并没有完全消失,说明卷枝毛霉生物体内还有其他代谢途径可以将碳源转化为GLA。

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。

玉米丁布葡萄糖苷-4-羟基甲基化酶基因bx12的克隆及其原核表达

为阐明丁布葡萄糖苷-4-羟基甲基化酶在玉米抗蚜和抗螨中的作用,该研究以4个对蚜虫和叶螨抗性不同的玉米自交系为材料,克隆编码丁布葡萄糖苷-4-羟基甲基化酶的基因bx12,并进行了原核表达。结果表明:除自交系Mo17-476M外,其余3个自交系B73、ZaC546和Mo17-476W的基因组中都分离到含有由744个碱基所构成的bx12基因开放阅读框的目标DNA片段,都编码由247个氨基酸组成的同一种蛋白BX12P;该蛋白与参考基因编码的蛋白氨基酸序列的一致性为100%。生物信息学分析表明,BX12P是一种多功能酶,属于依赖于S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的邻-甲基转移酶结构域超级家族,具有蛋白质二聚化功能、植物甲基转移酶功能和邻-甲基转移酶功能;该酶具有专一性地将丁布葡萄糖苷转化为4-甲氧基丁布葡萄糖苷的功能。利用克隆的bx12基因所构建的原核表达载体,经测序和通读结构鉴定,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功表达出了目的蛋白。

汉族人IL-12b和IL-10启动子区基因多态性与HBV感染的相关性

目的:我国是一个乙型肝炎大国,乙型肝炎感染及其转归显然有人种、人群差异。本研究对我国汉族人群中乙型肝炎病毒(hepatitis virus B,HBV)感染和发病与白介素-12p40(interleukin-12p40,IL-12b)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)启动子区基因多态性之间的关系进行了探讨。方法:利用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析(restricted enzyme-fragment length polymorphisms,PCR-RFLP)的方法对非相关人群的健康人群与HBV感染患者(轻、中度慢性肝炎、重度慢性肝炎)和HBV感染家系中的HBV携带者、既往HBV感染者、健康人群的IL-12b,IL-10启动子区-540C、-592A(IL10-5’A,IL12-5’C)单碱基多态性(SNP)进行了分析,并且对两个突变位点进行了基因测序。使用SAS统计软件进行统计分析。结果:IL10-5’A、IL12-5’C在非相关人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。非相关人群IL10-5’A、IL12-5’C突变等位基因在HBV患者中的频率近似于健康人群(IL10-5’A,HBV患者42.08％,健康人41.9％,P>0.05;IL12-5’C,HBV患者55.8％,健康人64.6％,P>0.05)。IL10-5’A与IL12-5’C基因分布在慢性肝炎(轻中)和慢性肝炎(重)两组无显著性差异(P>0.05)。提示IL10-5’A,IL12-5’C单碱基多态性(SNP)对乙型肝炎病情轻中无影响;HBV感染家系中IL10-5’A,IL12-5’C单碱基多态性在携带者、健康人群以及既往感染者三组间均匀分布,IL12-5’C突变频率与非相关人群相似(非相关人群-540T 55.3％,相关人群-540T 55.9％);IL10-5’A 突变频率与非相关人群有显著性差异(非相关人群-592C42.0％,相关人群-592C 19.5％,P<0.01)。结论:IL10-5’A突变比IL12-5’C突变在HBV感染家系中可能起到更重要的作用,或影响相关人群对HBV的易感性。

人14-3-3 γ基因的腺病毒载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒表达载体并确定其对PC12细胞的感染效率。方法:采用PCR方法,从Top10/pHis-14-3-3γ质粒中扩增14-3-3γDNA序列,将14-3-3γ基因定向克隆到穿梭质粒载体pAdTrack-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1载体同源重组后得到携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒(pAd/14-3-3γ),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外感染PC12细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western Blot检测14-3-3γ蛋白的表达。结果:克隆得到人14-3-3γ基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染PC12细胞。结论:本实验成功构建了表达14-3-3γ的复制缺陷型重组腺病毒Ad-14-3-3,为用14-3-3γ基因治疗帕金森病奠定了基础。

乙型肝炎病毒C基因启动子变异与白细胞介素10与12、肿瘤坏死因子α、γ-干扰素及病毒含量的关系

目的探讨慢性肝病患者乙型肝炎病毒C基因启动子变异(HBV BCP)与血清白细胞介素10(IL-10)、12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)及病毒含量(HBV DNA)的关系。方法采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染者(慢性乙型病毒性肝炎轻、中、重度,肝炎肝硬化,慢性重型肝炎和原发性肝癌)血清进行检测HBV BCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764碱基G→A联合突变;采用双抗体夹心ELISA检测技术,检测患者血清细胞因子(IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ)水平。结果HBVBCP变异阳性组、阴性组间对细胞因子(IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ)及HBV DNA复制水平的影响差异有统计学意义(P<0.05),BCP变异阳性组的血清IL-10(80.96±30.86vs72.11±24.19 mg/L)I、L-12(41.33±15.10vs35.98±14.47 mg/L)、TNF-α(56.04±27.05vs38.01±10.49 mg/L)、IFN-γ(19.81±12.29vs16.55±8.99mg/L)和HBV DNA(108.2478±0.9826vs105.8876±1.4822拷贝/ml)的水平明显高于BCP变异阴性组。结论HBV BCP变异可导致血清IL-10I、L-12、TNF-α、IFN-γ和病毒复制水平增高。

转基因玉米双抗12-5-21的抗虫性及对草甘膦的耐受性

【目的】评价转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因玉米双抗12-5的杂交后代双抗12-5-21对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫的抗性及对目标除草剂草甘膦的耐受性。【方法】分别在6叶期和花丝期、6叶期、花丝期对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫进行田间人工接虫;自然条件下,收获期剖秆调查双抗12-5-21对鳞翅目害虫的抗性;在玉米5叶期分别喷施推荐剂量中剂量及2、4、6倍中剂量草甘膦,药后1、2、4周调查玉米受害情况。【结果】6叶期及花丝期,双抗12-5-21受亚洲玉米螟为害的虫害平均级值分别为1.12和1.07;6叶期,双抗12-5-21受黏虫为害的虫害平均级值为1.32;花丝期,双抗12-5-21受棉铃虫为害的虫害平均级值为0.02。双抗12-5-21对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫抗性均达高抗水平。收获期剖秆结果显示,双抗12-5-21蛀孔数、活虫数及受害株率均显著低于对照玉米,对鳞翅目害虫控制效果达90%以上。喷施中剂量草甘膦,双抗12-5-21完全无受害症状;喷施2、4倍中剂量草甘膦后1周,双抗12-5-21表现轻微药害,2周后玉米完全无受害症状;双抗12-5-21喷施6倍中剂量的草甘膦后2周,受害率由1周的36.00%降为8.00%,新生叶片正常,4周后双抗12-5-21生长完全恢复正常,株高未受影响。【结论】转基因玉米双抗12-5-21田间对亚洲玉米螟、黏虫、棉铃虫的抗性均达高抗;双抗12-5-21能够耐受4倍中剂量草甘膦。

IL-12对小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的免疫学作用

目的 研究小鼠肥大细胞瘤P815基因疫苗和鼠IL 12对该疫苗的免疫学作用。方法 将小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原基因P1A克隆到真核表达质粒pCI neo中 ;用P815细胞对DBA/ 2小鼠右腹侧皮下注射 ,构建P815小鼠肿瘤模型 ;以重组基因疫苗单独或与鼠IL 12真核表达质粒一起肌肉注射 ,观察肿瘤的消长、特异细胞毒T淋巴细胞激活和抗体的生成情况。结果 重组基因疫苗在体外有很好的表达 ,注射后CTL的杀伤效率为 4 0 % ,IL 12共注射的CTL杀伤效率达到 6 0 %。免疫后 ,30 %小鼠的肿瘤出现消退 ;同IL 12共注射则有 5 0 %的小鼠的肿瘤出现消退。 2种情况下都不能检测到任何特异抗体的产生。结论 重组P1A肿瘤疫苗能有效激活机体的肿瘤特异免疫应答 ;基因疫苗对小鼠P815肿瘤的治疗作用主要归因于细胞免疫 ;IL 12有增强这种免疫应答的作用。

马立克氏病病毒编码的miR-M12-5p对鸡HVCN1基因表达的靶向调控

为研究miR-M12-5p在马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的调控作用,利用生物信息学方法对其候选靶基因进行预测分析,发现4个miR-M12-5p的结合靶点。体外双荧光素酶报告试验结果表明,miR-M12-5p可结合宿主鸡的氢离子电压门控通道1(HVCN1)基因mRNA的3'-UTR相应位点并发生特异性相互作用。实时荧光定量PCR分析进一步证实,miR-M12-5p能够在体内下调HVCN1基因的表达水平。上述结果表明,miR-M12-5p可以靶向调控宿主基因HVCN1的表达。

普通油茶两个Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列特征及表达模式研究

[目地]研究普通油茶油脂成分形成的调控机制。[方法]通过转录组测序获得2条普通油茶Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列,分别命名为Cofad6和Cofad2-2,并对这两个基因及其编码蛋白的序列特征进行比较,对其基因表达量与脂肪酸成分含量的相关性进行分析。[结果]Cofad6基因c DNA编码区全长1 347 bp,编码448个氨基酸;Cofad2-2基因c DNA编码区全长1 152 bp,编码383个氨基酸。经比对,Co FAD6蛋白与其余物种FAD6蛋白有65.7%83.68%的氨基酸同源,Co FAD2-2与浙江红花油茶FAD2-2蛋白有99.22%的氨基酸同源,与其余物种的蛋白质78.59%81.72%同源。蛋白质二级结构分析表明,Co FAD6和Co FAD2-2均具有一个脂肪酸去饱和酶结构域,属于脂酰-Co A去饱和酶基因家族;两者均为跨膜蛋白,且Co FAD2-2具有定位于内质网的保守模序。定量PCR检测发现,在普通油茶‘长林4号’无性系未成熟种子中,Cofad6表达量随着种子发育先升高后降低,而Cofad2-2基因随着种子发育表达量逐渐降低,与种子油脂中亚油酸、亚麻酸含量变化趋势呈显著正相关,与油酸含量变化呈显著负相关。[结论]推测Cofad2-2基因是调控普通油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量的关键基因之一,该研究为普通油茶油脂改良基因工程育种奠定了基础。

脂质体介导mIL-12基因与MHCⅠ基因联合对小鼠实验性肝癌的治疗作用

背景与目的:白细胞介素-12及MHCⅠ基因均已单独用于肿瘤基因治疗。为探索两者的抗肿瘤协同效应,本研究探讨小鼠白细胞介素-12(mIL-12)基因与同种异型的MHCⅠ(小鼠为H-2K)基因联合治疗Balb/C小鼠实验性肝癌。方法:分别应用含mIL-12基因、C57BL/6小鼠H-2KbcDNA及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒载体pcDNA3,体外经新型脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导转染小鼠肝癌细胞株MM45T.Li,检测转染细胞外源基因的表达。将经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,注射于小鼠皮下,观察致瘤性的变化。在荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射上述脂质体-DNA复合物,观察瘤体生长情况及小鼠生存期的改变。结果:LF2000介导pcDNA3/GFP转染MM45T.Li细胞的最佳条件为脂质体与DNA为3∶1(μg∶μg),转染效率达30%。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,RT-PCR检测有mIL-12和H-2KbcDNA的特异扩增片段,WesternBlot检测显示有57kDaH-2Kb蛋白表达,ELISA检测mIL-12分泌量达48ng/ml/106细胞。经LF2000介导pcDNA3/mIL-12与pcDNA3/H-2Kb转染的MM45T.Li细胞,其致瘤性下降;荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射该脂质体-DNA复合物,FACS检测显示小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+的数量治疗组较对照组高,?

人白介素-12转基因马铃薯中hIL-12的表达

[目的]研究人白介素-12转基因马铃薯中hIL-12的表达。[方法]采用ELISA和WesternBlot,检测转基因马铃薯中hIL-12的表达情况。[结果]转基因马铃薯叶与块茎中均能被hIL-12p70二聚体特异性的抗体识别的蛋白表达,与野生对照组相比均有0.01水平显著差异。WesternBlot分析结果显示,在40kD处有特异性的蛋白条带出现。[结论]所建立的人白介素-12转基因马铃薯表达体系能正确、有效表达hIL-12二聚体。

重组人IL-12真核表达载体的基因佐剂功能

目的探讨重组人IL-12真核表达载体(pcDNA6-p70)对核酸疫苗(HCMV pp65基因重组腺病毒,Adeno-pp65)的基因佐剂功能。方法pcDNA6-p70与Adeno-pp65共免疫BALB/c小鼠,每2周1次,共4次,同时设立Adeno-pp65对照组及生理盐水对照组。于初次免疫后第6周末尾静脉取血,第9周处死小鼠,分离脾细胞,分别检测细胞内细胞因子水平、CTL杀伤活性、特异性淋巴细胞增生和IFN-γ水平,并观察pcDNA6-p70对小鼠的安全性。结果共免疫组HCMV特异性CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于Adeno-pp65组及生理盐水对照组,差异均有显著意义;其CTL杀伤活性、HCMV特异性淋巴细胞增生水平及脾淋巴细胞特异性IFN-γ释放水平均高于Adeno-pp65组和生理盐水对照组,差异均有显著意义。pcDNA6-p70肌肉注射昆明小鼠,其体温、体重及一般情况与对照组差异均无显著意义。结论pcDNA6-p70与Adeno-pp65共免疫可提高核酸疫苗的免疫效果,且具有较好的安全性。

利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms12-1

根据p/tms12-1基因存在的单核苷酸变异,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)的方法设计特异引物,对11个两系不育系水稻品种(或品系)以及2个常规稻品系进行扩增。根据其PCR产物带型,可以准确鉴定光温敏核不育基因p/tms12-1的基因型,其检测结果与通过CAPS标记检测的结果完全一致。该方法成本低、简单、可靠,可用于p/tms12-1基因的鉴定和分子标记辅助育种。

IL-12家族基因多态性对细胞因子合成及老年重症全身感染预后的影响

目的探讨白细胞介素(IL)-12家族基因多态性中等位基因对细胞因子合成及老年重症全身感染预后的影响。方法选取老年重症全身感染患者48例为研究组,同期健康老年志愿者50人为对照组。盐析法提取两组受试者基因组DNA后行IL-12A(内含子6区含46 bp的同向重复结构)、IL-12B(启动子区511位点多态性)、IL-12RN(内含子2区含86 bp的同向重复结构)基因多态性分析。分离对照组外周血单核细胞,体外培养并使用脂多糖刺激,RT-PCR分析细胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆细胞因子浓度。结果研究组患者中等位基因IL-12RN携带者明显多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);IL-12A2、IL-12B2、IL-12RN2携带者的死亡率均明显增加。体外细胞学研究显示,等位基因IL-12RN2较IL-12RN1携带者外周血单核细胞在经脂多糖刺激后细胞因子IL-12ra mRNA表达水平和分泌量均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而IL-12A2、IL-12B2各等位基因不影响相应细胞因子的表达。结论 IL-12家族等位基因IL-12RN2通过上调细胞因子IL-12ra表达来影响老年重症全身感染患者的预后。

携带mIL-12基因逆转录病毒载体的构建与表达

目的:构建携带小鼠IL-12(mouseIL-12,mIL-12)基因逆转录病毒表达载体pLXmIL-12SN并检测其在B16F10细胞中的表达。方法:应用限制性内切酶从载体pGCp35-IRES-p40SN中酶切p35-IRES-p40(mIL-12基因片段)及将逆转录病毒载体pLXSN切开,通过连接酶连接,通过序列测定确定p35-IRES-p40基因片段正向插入载体pLXSN中的重组子,将阳性重组子转染B16F10细胞并通过RT-PCR方法检测mIL-12基因在B16F10细胞中表达。结果:成功地构建表达载体pLXmIL-12SN并可在mRNA水平检测到mIL-12基因在B16F10细胞中表达。结论:载体pLXmIL-12SN的构建成功及可在B16F10细胞中表达,为mIL-12基因治疗眼部疾病的研究奠定了基础和提供了借鉴。