花生△12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在酿酒酵母中的表达及功能分析

花生油中亚油酸(LA,C18:2Δ9,12)含量很高,为了研究花生Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12 FAD)的功能,用RT-PCR方法从花生未成熟种子中扩增出AhFAD2B的cDNA,连接到酵母表达载体p416中,并转化酿酒酵母K601,得到工程菌Kp4AFAD2B。气相色谱分析脂肪酸成分,结果表明该基因能在酵母K601中表达,并使菌株产生了两种新的脂肪酸即棕榈二烯酸(C16∶2Δ9,12)和亚油酸(C18∶2Δ9,12),含量分别占总脂肪酸的2.1%和9.2%,棕榈油酸(C16∶1Δ9)和油酸(C18∶1Δ9)含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的Δ12脂肪酸脱氢酶除能作用于C18∶1Δ9,还具有催化16碳的C16∶1Δ9底物在Δ12位脱氢生成C16∶2Δ9,12的功能,但在两种底物之间可能更偏爱C18∶1Δ9。

花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA,应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段,分别命名为FAD2-1和FAD2-2,将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连,在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因,进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,酶切鉴定后进行测序,结果表明,所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列,FAD2-2的长度为593bps,与引用序列的同源性达到97%,包含一个起始密码子;FAD2-1的长度为1175bp,与引用序列的同源性达到99%,包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。

农杆菌介导的花生Δ^(12)脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将倒位重复Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生。经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生。

△12-脂肪酸脱氢酶及其编码基因研究进展

△12-脂肪酸脱氢酶是催化脂肪酸链第12位碳原子形成双键的脱氢酶类,控制着油酸、亚油酸和其他多种不饱和脂肪酸的合成和含量。△12-脂肪酸脱氢酶根据电子供体不同可以分为fad2型和fad6型,fad2又可以分为管家型fad2和种子特异型fad2,fad2型和fad6型具有相同功能,但亲缘关系较远。fad2型编码基因在植物中一般有多个拷贝。本研究从△12-脂肪酸脱氢酶的结构和功能、分类、系统进化、生理学作用、基因克隆、基因结构和拷贝数等方面对其研究进展进行了综述,对相关研究领域的未来研究方向进行了展望。

普通油茶两个Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列特征及表达模式研究

[目地]研究普通油茶油脂成分形成的调控机制。[方法]通过转录组测序获得2条普通油茶Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列,分别命名为Cofad6和Cofad2-2,并对这两个基因及其编码蛋白的序列特征进行比较,对其基因表达量与脂肪酸成分含量的相关性进行分析。[结果]Cofad6基因c DNA编码区全长1 347 bp,编码448个氨基酸;Cofad2-2基因c DNA编码区全长1 152 bp,编码383个氨基酸。经比对,Co FAD6蛋白与其余物种FAD6蛋白有65.7%83.68%的氨基酸同源,Co FAD2-2与浙江红花油茶FAD2-2蛋白有99.22%的氨基酸同源,与其余物种的蛋白质78.59%81.72%同源。蛋白质二级结构分析表明,Co FAD6和Co FAD2-2均具有一个脂肪酸去饱和酶结构域,属于脂酰-Co A去饱和酶基因家族;两者均为跨膜蛋白,且Co FAD2-2具有定位于内质网的保守模序。定量PCR检测发现,在普通油茶‘长林4号’无性系未成熟种子中,Cofad6表达量随着种子发育先升高后降低,而Cofad2-2基因随着种子发育表达量逐渐降低,与种子油脂中亚油酸、亚麻酸含量变化趋势呈显著正相关,与油酸含量变化呈显著负相关。[结论]推测Cofad2-2基因是调控普通油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量的关键基因之一,该研究为普通油茶油脂改良基因工程育种奠定了基础。

Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

把高山被孢霉 (Mortierellaalpina)和深黄被孢霉 (Mortierellaisabellina)的Δ1 2 脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET2 1a中 ,获得重组表达载体pMACL1 2和pMI CL1 2 ,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌BL2 1 (DE3)中。筛选阳性克隆进行培养 ,然后分离其细胞膜蛋白 ,并构建体外表达体系 ,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱 (GC)分析表明 ,分别有 1 7 87%和 1 7 60

花生△^(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。

‘航花2号’的Δ^(12)脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的生物信息学分析

植物中的Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是油酸形成亚油酸的关键酶。通过NCBI和EXPASY 2大数据库,采用Signal P、TMHMM、Psort、Prot Param和Target P等分析程序对花生品种‘航花2号’及其它物种的19个FAD2蛋白序列进行分析,利用MEGA6.0软件比对序列及构建系统进化树阐明FAD2基因的系统发育关系,亲缘相近的FAD2蛋白聚在一起。预测了‘航花2号’和‘粤油13’的FAD2蛋白的分子质量、等电点、信号肽、跨膜和保守结构域等。结果表明:‘航花2号’FAD2蛋白的N端没有信号肽,预测定位在微体、细胞质、线粒体基质和叶绿体类囊膜中,而C端信号基序LKGL使得FAD2蛋白选择性地结合和嵌入内质网,植物的FAD2蛋白普遍有3个高度保守的组氨酸富集基序(HECGHH、HRRHH和H[A/C/T]HH)和3~5个跨膜结构,但分析结果显示,‘航花2号’的FAD2蛋白的H[A/C/T]HH的组氨酸基序是缺失的,而油酸转化为亚油酸的效率上并没有显著变化,为将来FAD2基因的基因工程操作提供一定的理论基础。

“自我剪切”2A肽介导的Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶以及过氧化氢酶在转基因小鼠肌肉表达研究

哺乳动物因为缺乏Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶,不能自身合成必需的多不饱和脂肪酸.目前,通过转基因技术在哺乳动物体内表达ω-3脂肪酸脱氢酶,能将长链的n-6多不饱和脂肪酸转化成n-3多不饱和脂肪酸,造成体内长链的n-6多不饱和脂肪酸含量显著减低.本研究通过自我剪切2A肽介导Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶(FAT-2和FAT-1)以及人过氧化氢酶(human catalase,hCAT)在小鼠的肌肉同时表达.结果表明,转基因小鼠肌肉中长链n-3多不饱和脂肪酸含量提高2.6倍,长链n-6多不饱和脂肪酸含量没有显著变化,而n-6/n-3比例显著降低(P<0.01).同时蛋白质印迹检测到人过氧化氢酶hCAT在小鼠的肌肉组织中表达,且过氧化氢酶活性比野生型小鼠显著提高(P<0.01).

少根根霉△^12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△^(12)-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体 pPIC3.5K 连接构建了重组表达载体 pPI-CRAD12,经 Sac Ⅰ线性化后电击转化毕赤酵母菌株 GS115获得转基因酵母菌株 PICRAD12.PCR 鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△^(12)-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。

深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ 亚麻酸 (GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸 ,在大多数油料作物种子中不含有GLA ,而只含有其前体物亚油酸 ,只有少数油料植物种子中含有GLA ,如夜来香 (Oenotheraspp) ,琉璃苣(Boragoofficinalis)等。Δ6 脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA ,我们将从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,与植物表达载体pGA6 43连接 ,构建了重组质粒pGAMICL6 ,将其通过农杆菌介导法 ,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中 ,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析 ,结果显示 ,GLA和十八碳四烯酸 (OTA)分别占总脂肪酸含量的 19 7%和 3 5 %。

少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H165,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达。同样,用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3 5K连接 ,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD116 8,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达 ,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱 质谱 (GC MS)联用分析表明高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达 ,γ 亚麻酸含量占总脂肪酸的 16 2 6 %。

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC1 62 66总DNA中扩增出大小为 1 374bp和 1 947bp的两条特异片段 ,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为 5 73bp的内含子和两条分别为 1 97bp和 82 8bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明 ,该基因有两个长的跨膜疏水区和 3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物 ,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交 ,证明在其基因组中确实存在两个Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL6 1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2 0中 ,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析 ,检测到了γ 亚麻酸 ,说明克隆的D6D基因MAGL6 1能在酿酒酵母中进行功能性表达。

少根根霉Δ_-~6脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达(英文)

Δ6- 脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ6- 脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α- 亚麻酸在Δ6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的功能。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉△6 -脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽 5 - 7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 5 0mg L卡那霉素的选择培养基上培养 2 - 4w后 ,从子叶节处诱导出抗性不定芽。将不定芽转移到伸长培养基上 ,4 - 6w后长至 2 - 3cm高的再生苗。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2 - 6w生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中 ,部分移栽成活的T0 植株能正常开花结荚。从T0 植株上收获T1 种子 ,按株系种植。T0 和T1 代经PCR检测和DNA分子杂交分析 。