卷枝毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因的敲除及功能研究

γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)是人体所必需且具有多种生理功能的一种重要多不饱和脂肪酸。研究表明,卷枝毛霉等GLA生产菌株中△6-脂肪酸脱饱和酶(△6-Fatty acid desaturase,FAD6)是合成γ-亚麻酸的关键和限速酶,然而GLA是否惟一通过△6-脂肪酸脱饱和酶途径合成则目前还没有报道。作者以卷枝毛霉Mucor circinelloides EIM10 sp.为研究对象,以其FAD6基因的5'端启动子和3'端终止子为同源臂,潮霉素B抗性基因为筛选标记,构建了M.circinelloides EIM10 sp.△6-脂肪酸脱饱和酶FAD6的敲除载体p UMCD6-Hm B,转化进入制备好的原生质体中成功地敲除了FAD6基因,发现FAD6基因缺陷菌株GLA质量浓度比野生型对照菌株降低了50%以上,但GLA并没有完全消失,说明卷枝毛霉生物体内还有其他代谢途径可以将碳源转化为GLA。

微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor.pusillus)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53%,微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。此试验为进一步研究Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。

△~6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。

RNAi干扰油菜Δ^(12)-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNA i介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶(FAD2)干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(-βActin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明,转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNA i干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNA i干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。

海洋破囊壶菌Δ~4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板,扩增获得1.6kb的Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因(FAD4)。将FAD4酶切后连接到HindⅢ/XbaⅠ处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYFAD4。转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl,通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子。添加外源脂肪酸C22:5底物,半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22:6(占酵母总脂肪含量的41.13%),Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达。

高山被孢霉ω-3脂肪酸脱饱和酶基因在麦胚无细胞蛋白质合成系统中的表达

无细胞蛋白质合成系统具有快速、方便等特点,能表达对活细胞具有一定毒性的膜蛋白和抗菌肽,近年来被广泛应用。以来自产油丝状真菌高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成途径中的关键膜结合酶——ω-3脂肪酸脱饱和酶为研究对象,构建了适宜体外表达ω-3脂肪酸脱饱和酶的表达载体p IVEX WG1.4-FADS15,并利用麦胚无细胞蛋白质合成系统实现了对该基因的高效表达。同时,通过在麦胚无细胞蛋白质合成过程中添加脂质体的方法,将所表达的膜蛋白正确定位至脂质体磷脂双分子层,以便目标蛋白质的正确折叠。研究结果显示,在此实验条件下目标蛋白质的表达量达1.8 mg/m L,经碘海醇密度梯度超速离心纯化后,该蛋白质的纯度可以达到90%以上。研究结果为后续对该酶进行催化特性研究和蛋白质晶体结构解析奠定了基础。

一种新ω-3脂肪酸脱饱和酶的克隆表达和活性鉴定

ω-3脂肪酸脱饱和酶催化ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)转化为ω-3 PUFAs,对ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)的合成至关重要。为了实现在常温下发酵生产ω-3 LC-PUFAs(主要是二十碳五烯酸,EPA),根据现有常温下偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脱饱和酶序列,从Gen Bank数据库筛选出与之高度相似的序列并进行生物信息学分析。为了确定序列的生物活性,进一步在酿酒酵母系统中进行重组表达,通过外源添加不同碳链长度的脂肪酸底物,测定重组酿酒酵母转化子在28℃和12℃下对不同脂肪酸的转化率。结果显示,新筛选序列编码的蛋白oAiFADS17既能催化18C PUFAs,又能催化20C PUFAs,尤其偏好催化二十碳四烯酸(AA)转化为EPA。oAiFADS17蛋白在28℃下对各种底物的转化率均高于12℃下的转化率,其中对AA的转化率达到46.3%。该研究成功测定了oAiFADS17蛋白对不同脂肪酸底物的转化率,得到了一种新的常温偏好催化20C PUFAs的ω-3脂肪酸脱饱和酶,为构建高产EPA的基因工程菌株及EPA的工业化生产奠定了理论基础。

三角褐指藻Δ^6脂肪酸脱饱和酶基因克隆及其表达分析

γ-亚麻酸在人类的健康与营养中具有重要的功能,利用基因工程手段提高其产量是满足其需求日益增大的途径之一。Δ6脂肪酸脱饱和酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶,催化亚油酸(C18∶2Δ9,12)到γ-亚麻酸(C18∶2Δ6,9,12)的反应。通过克隆三角褐指藻的Δ6脂肪酸脱饱和酶基因,并连入酵母表达载体pPIC3.5K中,在毕赤酵母中进行了表达,结果表明:重组酵母经甲醇诱导后表达转入的外源基因,气-质联用分析显示重组毕赤酵母中含有γ-亚麻酸和SDA(18∶4Δ6,9,12,15),其含量分别为2.5%和0.8%。

姬松茸ω-6多不饱和脂肪酸对高血脂鼠的降血脂作用

目的:观察姬松茸ω-6多不饱和脂肪酸(-ω6APFA)对高血脂鼠的降血脂作用。方法:大鼠60只,随机分为空白对照组、模型组、天然大豆磷脂胶囊(NSPC)0.70 g.kg-1剂量组和-ω6APFA 0.28、0.14、0.07 g.kg-13个剂量组(n=10)。除空白对照组外均连续给予高脂饲料14 d,于第14天起开始连续灌胃给药14 d,对照组和模型组给予等容积蒸馏水10 mL.kg-1。实验结束后麻醉大鼠,腹主动脉取血测血清总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)。同时测肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性、肝脏丙二醛(MDA)含量及腹腔脂肪蓄积系数。雄性小鼠72只,随机分为空白对照组、模型组、NSPC 1.0 g.kg-1剂量组、-ω6APFA 0.4、0.2、0.1 g.kg-13个剂量组(n=12),连续给药7 d,末次给药前16 h除空白对照组,均腹腔注射75%蛋黄生理盐水液0.5 mL,并开始饥饿,末次给药后1 h,于眼球采血,测血清T-CHO及TG含量。结果:与模型组比较,NSPC 0.70 g.kg-1和-ω6APFA 0.28 g.kg-1剂量组大鼠血清T-CHO、TG均明显降低,血清HDL-C升高(P<0.001);NSPC 0.70 g.kg-1和-ω6APFA 0.28、0.14 g.kg-1剂量组大鼠肝组织SOD活性升高(P<0.05、P<0.001及P<0.05),MDA降低(P<0.01、P<0.001及P<0.01),大鼠腹腔脂肪系数均降低(P<0.01)。与模型组比较,NSPC 1.0 g.kg-1、-ω6APFA0.4、0.2 g.kg-1组急性高血脂小鼠T-CHO和TG明显降低(P<0.05、P<0.01及P<0.05)。结论:ω-6APFA对高血脂鼠有明显的降血脂作用。

不同比例ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸对DSS诱导大鼠急性结肠炎的影响

目的:探讨不同比例ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导大鼠急性结肠炎影响及其可能的作用机制.方法:32只1月龄♂SD大鼠随机分为4组,每组8只,A:普通饲料对照组,B:ω-3/ω-6PUFA 1∶1组、C:ω-3/ω-6 PUFA 1∶3组,D:ω-3/ω-6 PUFA 1∶30组.4组大鼠不同饲料喂养6 wk;随后B、C、D组大鼠自由饮用3%DSS溶液7 d,诱发急性结肠炎模型;A组大鼠自由引用普通水7 d.比较各组大鼠结肠炎症状评分、病理炎症评分和结肠组织前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、核因子-kB(nuclear factor-kB,NF-kB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、血清白介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量.结果:B组大鼠结肠炎症程度积分显著低于C、D组,分别为2.8±1.2、4.3±1.1、5.6±1.3(P<0.05,P<0.01).B组大鼠结肠炎病理学评分显著低于C、D组,分别为3.2±2.0、35.0±28.8、27.0±25.8(P<0.01,P<0.01).B、C组大鼠结肠组织中PGE2含量低于D组,分别为443.4ng/100g组织±67.3 ng/100g组织、419.5ng/100g组织±52.6 ng/100 g组织、541.2±68.5(ng/100 g组织)(P<0.05,P<0.01).B、C组大鼠结肠组织中TNF-α含量低于D组,分别为189.2 ng/100g组织±27.0 ng/100 g组织、173.2 n g/100g组织±50.2 n g/100 g组织、270.3 ng/100g组织±49.1 ng/100 g组织(P<0.01,P<0.01).B组大鼠血清中IL-6含量低于C、D组,分别为97.1 ng/L±8.2 ng/L、129.1 ng/L±5.5 ng/L、125.4 ng/L±19.6 ng/L(P<0.01,P<0.05).B、C、D大鼠结肠组织中NF-kB含量分别为497.9 ng/100g组织±50.7 ng/100 g组织、569.1 ng/100g组织±121.2 ng/100 g组织、582.5 ng/100g组织±123.1 ng/100 g组织,无统计学差异.结论:提高以ω-3/ω-6 PUFA的比例对于DSS诱导的大鼠急性结肠炎症具有保护作用,尤其是当ω-3/ω-6 PUFA比例提高到1∶1保护作用最明显.随着ω-3 PUFA的比例升高,ω-3/ω-6PUFA1∶1组较ω-3/ω-6 PUFA1:30组大鼠的炎症评分、病理评分以及相关的炎症因子如PGE2、TNF-α、IL-6都有所下降.向饮食中添加适量ω-6 PUFA或可成为治疗炎症性肠病新方向.

禽蛋ω-3系列、ω-6系列多不饱和脂肪酸含量研究

通过气相色谱法测定不同种类鲜禽蛋、蛋制品中ω-3、ω-6脂肪酸组成和含量，并得ω-6／ω-3比值；结果表明，强化ω—3脂肪酸鸡蛋中ω-3脂肪酸含量为450-800mg／100g，相对于其它鲜禽蛋、蛋制品类含量更高，ω-6／ω-3比值为1．5～2．4。

ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸对血脂代谢影响及相关机制

血脂异常与心脑血管系统疾病的发生密切相关，其主要发病机制是造成动脉粥样硬化。临床多项循证医学证据表明，高胆同醇血症尤其是LDL—C的升高是造成动脉粥样硬化的独立危险因素之一。此外，高脂血症也是高血压、糖耐量异常、糖尿病、缺血性脑卒中等疾病的一个重要危险因素。

ω-3多不饱和脂肪酸对去卵巢大鼠骨钙素和白细胞介素-6的影响

目的:探讨ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFA)治疗对去卵巢大鼠血清骨钙素(BGP)和白细胞介素-6(IL-6)的影响。方法:将60只雌性大鼠随机分为去卵巢(OVX)组、雌二醇(E2)组、小剂量ω-3 PUFA组、中剂量ω-3 PUFA组、大剂量ω-3 PUFA组和假手术(Sham)组。用药90 d后,采血测定血清BGP和IL-6。结果:OVX组大鼠血清BGP有升高趋势,IL-6显著升高。E2组和ω-3 PUFA小、中、大剂量组BGP均有显著下降,IL-6均有下降趋势。结论:ω-3 PUFA能降低去卵巢大鼠血清BGP水平,从而改善骨质的高转换状态,减少绝经后的骨质丢失。

姬松茸ω-6多不饱和脂肪酸对鼠的抗血栓作用

目的:观察姬松茸ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6APFA)抑制血栓形成及活血化瘀作用。方法:60只大鼠随机分为空白对照组(n=12)、天然大豆磷脂胶囊(NSPC)0·70g·kg-1·d-1剂量组(n=12)和ω-6APFA0·07、0·14及0·28g·kg-1·d-13个剂量(n=12)组,各组均连续灌胃给药7d,末次给药后1h于动物腹腔注射300mg·kg-1水合氯醛麻醉,分离右侧颈总动脉,应用实验性体内血栓形成测定仪检测血栓形成时间。另取60只小鼠,随机分为空白对照组(n=12)、NSPC1·0g·kg-1·d-1剂量组(n=12)和ω-6APFA0·1、0·2、0·4g·kg-1·d-13个剂量组(n=12),各组均连续灌胃给药7d,于末次给药后1h小鼠眶静脉采血,采用玻片法测定凝血时间。结果:NSPC0·70g·kg-1·d-1剂量组及ω-6APFA0·14及0·28g·kg-1·d-1剂量组均对大鼠体内血栓形成有明显抑制作用,与对照组比较差异均有显著性(P<0·05),且ω-6APFA0·14及0·28g·kg-1·d-1剂量组优于NSPC0·70g·kg-1·d-1剂量组。NSPC1·0g·kg-1·d-1剂量组及ω-6APFA0·2、0·4g·kg-1·d-1剂量组均能延长小鼠凝血时间,与对照组比较差异均有显著性(P<0·05),ω-6APFA0·2及0·4g·kg-1·d-1剂量组优于NSPC1·0g·kg-1·d-1剂量组。结论:ω-6APFA有很好的抑制血栓形成及活血化瘀作用。

饮食多不饱和脂肪酸ω-3/ω-6比值对小鼠实验性结肠炎的影响

目的:探讨多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)ω-3/ω-6比例的改变对葡聚糖硫酸钠(dex-tran sulfate sodium,DSS)诱导的实验性结肠炎小鼠炎症程度的影响。方法:32只4周龄雄性BALB/c小鼠,随机分为对照组和PUFA组,PUFA组又分为ω-3/ω-6 1∶3组、ω-3/ω-6 1∶15组及ω-3/ω-6 1∶30组,每组8只。对照组给予普通饲料饲养,饲料中PUFAω-3/ω-6为1∶15;PUFA组小鼠依组别给予相应的改良饲料,8周后给予DSS(30 g/LDSS饮用5 d后改为蒸馏水饮用10 d,共3个循环)诱发实验性结肠炎。比较各组症状评分、组织病理学评分和结肠黏膜组织前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平。结果:饲料中PUFAω-3/ω-6比值改变对生长期小鼠体重的增长没有影响。虽然从体重增长、粪便性状和便血情况这3个单独症状评分对PUFA 3组进行比较差异无统计学意义,但总体症状评分在3组间差异有统计学意义,进一步的比较显示1∶3组总体症状评分显著低于1∶30组(P<0.05)。组织病理学评分在PUFA 3组间差异具有统计学意义,1∶3组明显低于1∶30组(P<0.05)。检测反映肠道炎症水平的黏膜PGE2水平后发现,在炎症改变明显的远段结肠,1∶15组及1∶30组黏膜PGE2水平显著均高于对照组(P<0.05),而1∶3组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);在没有炎症改变的近段结肠,1∶30组黏膜PGE2水平显著均高于对照组(P<0.01),而1∶3组及1∶15组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实验性结肠炎小鼠炎症程度和黏膜PGE2水平受饲料中PUFAω-3/ω-6比例变化的影响,增高PUFAω-3/ω-6比值对实验结肠炎小鼠肠道黏膜具有保护作用,反之则有加重炎症的危害。在炎症发生前,PUFAω-3/ω-6比值改变可能先使局部炎症因子产生变化,随后对炎症的严重程度产生影响。

不同比例ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸对大鼠慢性结肠炎模型的影响

目的研究不同比例ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导大鼠慢性结肠炎的影响。方法选取40只4周龄雄性SPF级SD大鼠,随机分为A^E共5组。A、E组予普通饲料喂养,B、C、D组大鼠分别予ω-3/ω-6 PUFA 1∶1、1∶3及1∶30的改造饲料喂养,共6周。随后除E组外,其余4组予3%DSS水溶液自由饮用7 d后,改为普通水饮用12 d,此为1个循环。如此反复3个循环,制造慢性结肠炎动物模型。记录各组大鼠体质量、粪便、一般情况,比较各组大鼠结肠炎症状积分、组织病理损伤积分和血清及结肠组织中PGE2、LTB4、TNF-α含量。结果ω-3/ω-6 PUFA 1∶1组大鼠可以降低DSS诱导的结肠炎大鼠的炎症症状总积分(P<0.05)、组织病理损伤积分(P<0.05),血清及组织中PGE2、LTB4、血清TNF-α均有所下降(P<0.05)。ω-3/ω-6 PUFA 1∶3组部分改善DSS诱导大鼠结肠炎,使DSS诱导慢性结肠炎大鼠组织中LTB4及血清中PGE2降低。ω-3/ω-6 PUFA 1∶30使DSS诱导慢性结肠炎大鼠炎症症状积分升高(P<0.001),加重组织病理损伤积分(P<0.05),组织中TNF-α含量升高(P<0.05)。结论含有高比例ω-3/ω-6 PUFA的饲料可以改善大鼠慢性结肠炎症状,比例1∶1效果优于1∶3,饲料中过高的ω-6 PUFA可以加重大鼠慢性结肠炎。因此推测将炎症性肠病患者膳食中ω-3/ω-6 PUFA比例提高可能使患者获益。

酶法纯化ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸研究进展

多不饱和脂肪酸(PUFAs)具有重要的生理学活性,尤其是ω-6和ω-3系列与人体健康密切相关。因此,如何提取PUFAs非常重要,也是油脂领域的研究热点。利用酶法分离纯化PUFAs是一种环保、高效、具有广泛应用前景的方法。本文综述了酶法纯化ω-6和ω-3PUFAs的最新研究进展,并着重阐述了酶法催化水解、酶法选择性富集以及其它几种能和酶法有效结合、共同分离纯化PUFAs的物理化学方法,同时通过论述亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等PUFAs的纯化进展证明了酶法在该领域内具有很大发展前景。

日粮中添加植物油对鸡蛋中ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸比例影响的研究

60只 5 2周龄蛋鸡分为五组 ,对照组饲喂基础日粮 ,试验组分别饲喂 3%的胡麻油 ,3%的菜籽油 ,3%的大豆油和 3%的花生油日粮 ,研究日粮中添加植物油对鸡蛋中ω 6和ω 3多不饱和脂肪酸比例的影响。结果表明 ,日粮中添加 3%植物油可明显提高生产性能 ,试验组鸡蛋中ω 6和ω 3多不饱和脂肪酸的比例都比对照组明显下降 ,试验 1组降低幅度最大 ,分别比对照组降低 88 73%、94 4 4%和 94 14 %。试验 1、2组 (2 0d、30d和 4 0d)两者之间的比例在适宜范围内。

日粮中添加植物油对鸡肉中ω-6多不饱和脂肪酸含量的影响

100只52周龄蛋鸡分为5组,对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中分别添加3%的胡麻油,3%的菜籽油,3%的大豆油和3%的花生油,研究日粮中添加植物油对鸡肉中ω-6多不饱和脂肪酸的影响。结果表明:日粮中添加3%植物油可明显提高生产性能,试验组鸡肉和肝脏中亚油酸(C18:2)的含量都明显高于对照组(P<0.05)。鸡肉和肝脏中试验3组亚油酸(C18:2)的含量分别比对照组提高27.2%和41.5%。

日粮中添加植物油对鸡肉中ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸比例影响的研究

60只 5 2周龄蛋鸡分为 5组 ,对照组饲喂基础日粮 ,试验组分别饲喂 3%的胡麻油、3%的菜籽油、3%的大豆油和 3%的花生油日粮 ,研究日粮中添加植物油对鸡肉中 ω- 6和 ω- 3多不饱和脂肪酸的比例分别比对照组下降 40 .80 %、36.81 %、2 2 %和 2 2 .42 %。肝脏中两者的比例试验组比对照组略有提高 ,试验 2和试验 3组分别提高 1 .66%和 1 .1 2 %。