ΔCREB真核表达载体的构建及对心肌细胞TNFα含量的影响

目的 :构建ΔCREB的真核表达载体 ,观察其对TNFα等细胞因子的影响 ,探索心衰发生发展的始动因素。方法 :利用穿梭质粒pAdTrack构建核转录因子ΔCREB的真核表达载体pAdTrack -ΔCREB ,然后转染培养的乳鼠心肌细胞。将心肌细胞随机分为空白对照组、forskolin(10 μmol/L)组、转染组和转染后加forskolin组 ,观察各组心肌细胞ΔCREB的表达以及TNFα含量的变化。结果 :①定量逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)显示 ,ΔCREB/β-actin定量比值 ,转染组 (1 0 0 10 16± 0 0 5 35 2 0 )明显高于对照组 (0 76 132 2± 0 0 4 4 0 90 ) ,(P <0 0 1) ;免疫细胞化学检测心肌细胞ΔCREB蛋白标记阳性率 ,转染组 (2 8 88% +9 0 5 % )亦明显高于对照组 (6 6 3% +3 38% ) ,(P <0 0 1)。②细胞上清TNFα含量 ,转染后加forskolin组 (34 36pmol/L± 12 17pmol/L)明显高于对照组 (16 91pmol/L± 5 16pmol/L) ,(P <0 0 1)。结论 :转染ΔCREB可显著升高心肌细胞TNFα含量。cAMP介导的CREB转录激活作用促进了TNFα基因表达 ,可能在心力衰竭的发展中起重要作用。

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV) HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体 pc DNA3的Kpn 酶切位点 ,快速筛选鉴定出含有 HB核蛋白基因的重组质粒 ,经酶切、PCR及 Southern鉴定为正向插入了 HB核蛋白基因 ,将其命名为 pc DNA-N。对重组质粒进行大量扩增 ,应用聚乙二醇纯化后 ,对 SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验 ,结果表明 ,IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。

鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体的构建

目的 构建肌肉转录调节因子 Myo D基因真核表达载体 ,为深入研究 Myo D在肌肉修复中的分子调节机制 ,探讨其在肌肉损伤方面的生物学行为 ,为临床应用提供物质基础。方法 含 Myo D c DNA的质粒PEMMBC2 β5于大肠杆菌 E.Coli DH5 a内扩增 ;提取及纯化 PEMMBC2 β5质粒 ;经 DNA序列分析含 Myo Dc DNA;限制性酶切 Myo D c DNA片段 ,连接酶连接到真核表达质粒 pc DNA3- neo内 ,克隆出真核表达载体pc DNA3/ Myo D。结果 提取及纯化的 PEMMBC2 β5质粒含有大小正确的 Myo D c DNA碱基片段 ,其碱基序列为编码目的基因的正确序列 ,凝胶电泳结果证明已将此片段正确地克隆到 pc DNA3/ Myo D内。结论 成功的构建了Myo D基因的真核表达质粒 pc DNA3/ Myo D。

重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应

目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析 ,证明反义载体构建成功。结论 应用RT PCR方法扩增插入DNA片段 ,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位 ,免去正反向筛选的麻烦。

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。

鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2·1TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2。[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。

pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达

目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达。结果 酶切证实基因片断正向连接于pCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达。结论 含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

pcDNA3-hNGF真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人神经生长因子(h NGF)真核表达载体pc DNA3-h NGF,检测其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法利用PCR扩增h NGF全长c DNA,构建真核表达载体pc DNA3-h NGF,经测序证实后将其转染至大鼠骨髓基质干细胞中,利用Western blot方法检测h NGF的表达情况。结果 DNA测序结果显示构建的pc DNA3-h NGF表达载体与实验设计相符。Western blot检测显示该重组载体转染大鼠BMSCs 72h后,有h NGF的过表达。结论构建的pc DNA3-h NGF能在骨髓基质干细胞过表达h NGF蛋白,本研究为应用神经生长因子修饰的骨髓基质干细胞进行骨折治疗奠定了基础。

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6。方法采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认。用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果。结果经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性。转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础。

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor ,bFGF)的荧光真核表达载体 ,以便进一步转染成骨细胞 ,研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术 ,将已经克隆的bFGF基因从PBR3 2 2 -bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP -C3 ,构建的重组质粒经脂质体介导转染 3T3细胞 ,3 6h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况 ,观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光 ;免疫组化检测bFGF的表达分泌情况 ,结果显示部分经转染的细胞呈阳性 (棕色颗粒 )。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP -C3 -bFGF ,并在 3T3细胞中表达了bFGF。

茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达

以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体,并转染宫颈癌HeLa细胞,进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果,为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因,以Pgenesil-1质粒为载体,构建重组体,根据Livin基因cDNA序列,设计shRNA寡核苷酸序列,退火后克隆到空载体Pgenesil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功,并被成功转入宫颈癌HeLa细胞,可见绿色荧光蛋白表达,48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体,为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。

人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建

目的 构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法 采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组质粒PsecTaq2A_AMG ,并对重组质粒进行鉴定。结果 ①PCR扩增产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,可见大小约 5 19bp的特异性条带 ,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A_AMG酶谱分析与预期结果一致 ,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论 用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。

大鼠肌细胞生成素基因真核表达载体的构建

目的 构建骨骼肌肌细胞生成素 (myogenin)基因真核表达载体 ,深入探讨在骨骼肌损伤及骨骼肌失神经萎缩的发生、发展过程中的变化规律 ,以及病理过程。 方法 含 myogenin c DNA的克隆载体 p GEMT- myogenin经限制性内切酶 Hind 和 Xho 双酶切 ,得到含这两个酶切位点之 myogenin c DNA片段 ,T4 连接酶连接到含有这两个酶切位点的真核表达载体 pc DNA3,构建出重组真核表达载体 pc DNA3- myogenin,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及 DNA测序证实 c DNA片段大小和序列的正确性。 结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实 :pc DNA3-myogenin含大小正确的 myogenin c DNA片段 ,DNA测序证实其 DNA序列正确。 结论 成功地构建了肌细胞生成素基因真核表达载体 pc DNA3-

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体。方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1(+)两者多克隆位点的特点,选用pGEMR○-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X。结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X构建成功。结论:具有不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体业已成功构建。

大鼠谷氨酰胺酶反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 :构建大鼠谷氨酰胺酶 (GA)反义真核表达载体。 方法 :采用分子克隆技术将rGAcDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中。 结果 :EcoRⅠ和HinDⅢ双酶切后 ,反义重组基因为 0 .2 8kb和 5 .4kb两条带 ,与理论计算相符。 结论 :成功构建了大鼠GA反义真核表达载体 。