猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。

crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。

cya/crp基因缺失对鸡白痢沙门菌生物学特性影响的研究

为了解crp/cya基因对鸡白痢沙门菌毒力和生物学特性的影响,本研究构建缺失1182 bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya,并经酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌χ7213作为供体菌,分别以鸡白痢沙门菌C79-13株和本研究室前期构建的其crp基因缺失株C79-13Δcrp(简写为Δcrp)为受体菌,利用重组自杀性质粒介导的同源重组技术构建C79-13菌株的单基因缺失株Δcya以及双基因缺失株ΔcrpΔcya,并均经PCR和测序鉴定。将这3株菌连续传60代后每隔10代分别利用PCR鉴定cya基因缺失的遗传稳定性;利用玻片凝集试验鉴定各菌株的血清型,并鉴定各菌株的生化反应特性;绘制各菌株的生长曲线分析缺失株与亲本株的生长特性;通过微量结晶紫法检测各菌株的生物被膜(BF)形成能力。PCR和测序鉴定结果显示Δcya、ΔcrpΔcya均正确构建,且cya基因缺失均具有稳定的遗传性。血清型及生化鉴定结果显示,菌株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya均保留了C79-13的O9血清型,而失去了发酵蔗糖、鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖等糖类的能力。生长曲线及BF形成能力的检测结果显示,各缺失株的生长速度较亲本株相比均显著降低,尤其双基因缺失株ΔcrpΔcya的生长速度极显著下降(P<0.01),且基因缺失株BF的形成能力均极显著降低(P<0.01),其中双基因缺失株BF的形成能力更低。将3株缺失菌及亲本菌分别以不同的剂量(5×10^(8)cfu/只~7×10^(11)cfu/只)经腹腔注射感染雏鸡进行毒力试验,计算各菌株对雏鸡的半数致死量(LD_(50))。将各缺失株以10^(7) cfu/mL两次经灌服免疫雏鸡,100μL/只,二免后7 d各组雏鸡均以5.0×10^(8)cfu/mL经腹腔注射亲本菌株C79-13进行攻毒试验,500μL/只,在42 d的观察期内观察并记录各组鸡的发病及死亡情况,计算各基因缺失株对雏鸡的免疫保护率。结果显示,缺失株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya对雏鸡的LD_(50)分别为2.84×10^(9) cfu/mL、1.41×10^(10)cfu/mL、2.51×10^(11)cfu/mL,与亲本菌株C79-13相比,各缺失株LD_(50)分别升高约1.1×10^(3)倍、5.7×10^(3)倍、1.0×10^(5)倍;各组雏鸡攻毒后出现精神沉郁症状,且有部分鸡死亡,PBS对照组鸡出现排稀便症状,且全部死亡。Δcya、Δcrp及ΔcrpΔcya对雏鸡的免疫保护率分别为60%、80%、50%。表明各基因缺失株均能够对雏鸡提供一定的免疫保护效果,且单基因缺失株Δcrp的免疫效果最好。本研究首次对鸡白痢沙门菌crp、cya基因生物学功能做了初步研究,并证实缺失株Δcrp有望作为一种鸡白痢沙门菌基因缺失疫苗的候选菌株,为研制安全有效的沙门菌弱毒活疫苗奠定了基础。

奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17 crp基因缺失株的构建及其生物被膜形成能力分析

为探究crp基因对奶牛乳腺源大肠杆菌生物学特性的影响,以奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,成功构建NJ17crp基因缺失株(NJ17-Δcrp)。对大肠杆菌野生株NJ17及crp基因缺失株的生长速率和生物被膜形成能力进行检测。结果表明,crp基因缺失影响奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17的生长速率,生物被膜形成能力显著降低(P<0.05)。

鼠伤寒沙门菌双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗候选株,在单缺失株SL1344Δcrp的基础上,运用自杀性质粒介导的细菌同源重组技术敲除sipB基因,构建了双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB。PCR及测序结果表明SL1344ΔcrpΔsipB构建成功。生物学特性研究表明,SL1344ΔcrpΔsipB血清型未发生变化,遗传性稳定。与亲本株SL1344相比,双缺失株的生长速度明显减慢,毒力降低了约99.9%以上。免疫保护效力试验显示,6周龄昆明小鼠口服免疫SL1344ΔcrpΔsipB后第17天,利用鼠伤寒沙门菌野生株攻毒,保护率为60%;免疫后第21天血清抗体效价达到峰值。上述结果为进一步研制安全有效的鼠伤寒沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株△crp△sipB缺失株生物学特性的检测

目的进一步深入研究△crp△sipB双基因缺失株的减毒机制。方法以鼠伤寒沙门菌亲本菌株SL1344和△crp△sipB双基因缺失株为研究对象，利用细菌在半固体培养基上形成的运动圈进行流动性的检测，通过比色法测定出乳酸、丙酮酸的含量以及上皮细胞增殖快慢。结果在半固体培养基上双缺失株形成的运动圈直径与亲本菌株相比发生了显著的降低，表明缺失株的运动能力弱于亲本株；对培养不同时间点的缺失株和亲本株菌体的丙酮酸、乳酸测定结果显示：缺失株菌体内的丙酮酸含量在培养后6、9和12h均高于亲本株组（P〈0．05），乳酸含量在9h以后也高于亲本株组（P〈0．05），结果表明缺失株的糖酵解能力高于亲本株组；对HeLa细胞的增殖和毒性试验结果表明，在感染细胞后各个时间点△crp△sipB基因缺失株组的A530值均高于亲本菌株组（P〈0．05），说明双基因缺失后对细胞增殖和细胞毒性的影响均弱于亲本菌株；△crp△sipB基因缺失后对上皮细胞的黏附和侵入能力与亲本菌株相比发生显著降低（P〈0．05）。结论上述结果为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统,并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株,利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术,经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344ΔcyaΔasd)。将含asd基因且无抗性的p YA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd,构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)。【结果】试验结果表明,重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大,与亲本株SL1344Δcya基本一致,SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明,SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示,1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(p YA3493)后第17天,利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒,保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功,且具有较好的免疫保护性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。