多酶一步纯化共固定系统的构建及催化不对称还原合成手性醇的研究

开发了一步纯化共固定老黄酶(OYE1)、醇脱氢酶(ADH-A)和葡萄糖脱氢酶(GDH)系统并一锅级联催化烯酮转化为手性醇类化合物,同时实现辅酶的原位再生。以镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)修饰的SiO_(2)纳米花为载体,对带有His-tag的目的蛋白ADH-A、OYE1和GDH粗酶液进行一步分离纯化及固定化,并在优化的反应条件下进行反应,对手性醇产物的产率最高可达92.37%。固定化酶相比于游离酶的稳定性更加出色。在连续5次循环使用后,固定化酶在使用时仍有较高的转化率。同时,固定化酶OYE1&ADH-A&GDH@Ni-NTA@SiO_(2)对环状、链状及芳香族烯酮类化合物均具有良好的催化性能。

卤代烷烃脱卤素酶标签α1A-肾上腺素受体色谱方法的建立与评价

受体色谱技术是将色谱技术的高分离能力和药物-受体间的高特异性识别能力结合起来的一种分析技术,能够对中药等复杂体系中靶向活性成分进行高效筛选与准确辨识。该技术的关键在于发展高效、温和、简便的固定化方法,使得固定化受体活性得以保持。传统的以生物交联剂为核心的随意共价固定化技术存在反应特异性较差、需要纯化蛋白质等不足。针对该问题,本研究将卤代烷烃脱卤素酶(Halo)与6-氯己酸的特异性生物正交反应引入至α1A-肾上腺素受体(α1A-AR)的固定化过程,将Halo标签α1A-AR一步固定至6-氯己酸修饰的氨丙基硅胶表面,无需对α1A-AR进行纯化。采用扫描电子显微镜和色谱法对Halo-α1A-AR色谱固定相进行形貌及活性表征,证明受体已成功固定且具有特异性识别配体的能力,30天内稳定性良好。非线性色谱法研究结果显示:盐酸哌唑嗪、盐酸特拉唑嗪和乌拉地尔通过一类结合位点与Halo-α1A-AR色谱固定相作用,结合常数分别为3.85×10^(5)、5.00×10^(5)和5.90×10^(5)L/mol;甲磺酸酚妥拉明和盐酸坦索罗辛在Halo-α1A-AR色谱固定相上则存在两类位点,前者与受体亲和力分别为3.12×106 L/mol和6.01×10^(5)L/mol,后者则为9.98×10^(5)L/mol和2.11×104 L/mol。与传统物理吸附法或N,N′-羰基二咪唑法制备的α1A-AR色谱柱相比,本文所用固定化方法无需纯化受体,在一定程度上避免了受体活性损失,实现了蛋白质一步固定化方法,亲和力测定值更接近于溶液中受体-药物的真值,为复杂体系靶向活性成分高效筛选与准确测定奠定了基础。

有机磷降解酶在重组大肠杆菌中的表达及一步纯化固定化

【背景】有机磷化合物作为一类广谱杀虫剂,因其用量大、毒性强且不易降解,在自然界中的残留已对环境造成了严重污染。【目的】有机磷降解酶(organophosphohydrolase,OpdA)可降解多种有机磷化合物,探究其被固定到NiCo2O4载体上后用于有机磷化合物的降解效果。【方法】构建含组氨酸标签(histidine tag,His-tag)的OpdA,以pET-28a(+)为载体,Escherichia coli Rosetta(DE3)为宿主细胞,在终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导下表达His-tagged OpdA。采用一步纯化固定化方法,实现固定化酶(OpdA@NiCo2O4)的制备。【结果】采用水热处理和煅烧制备了含过渡金属离子的NiCo2O4,利用过渡金属离子对酶分子表面组氨酸咪唑基的配位作用,实现了发酵粗酶液中His-taggedOpdA的一步纯化固定化,在优化条件下获得了高稳定性的OpdA@NiCo2O4;然后将其用于有机磷化合物的降解,在NaBH4存在条件下,通过级联反应和降解条件优化,实现了有机磷化合物的高效降解。【结论】该研究不但实现了重组酶的一步分离纯化和固定化,也为有机磷化合物的降解提供了一条安全、高效、环保的新途径。