A群轮状病毒一步法RT-ddPCR方法的建立

目的:建立A群轮状病毒(rotavirus,RV)一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法。方法:筛选特异性引物探针,建立并优化一步法RT-ddPCR方法,确定特异性;制备含A群RV目的片段的RNA标准物质,确定建立方法的检测限、准确度、重复性和复现性。A群RV阳性粪便样品梯度稀释后制作染毒液,制备人工染毒样品,分离病毒与食品基质,浓缩得到病毒悬液,提取RNA后,比较不同食品基质中一步法RT-ddPCR检测结果。结果:建立的一步法RT-ddPCR方法定量限为58000.00~5.80拷贝/μL,具有良好的特异性、准确性、灵敏度、重复性和复现性。各染毒水平下A群RV检出量和回收率在不同食品基质中存在显著性差异(P<0.05)。结论:研究建立的一步法RT-ddPCR方法可准确定量A群RV RNA,食品基质可影响一步法RT-ddPCR检测结果,通过病毒回收率可计算食品中A群RV的实际载量。

基于模板转换的微量RNA测序建库方案探索

目的:建立一套简便、对RNA样本起始量要求很低的RNA测序建库方法,在此基础上引入分子条形码技术,从而使RNA-seq的数据所反映的表达丰度更加客观真实。方法:将微量RNA用RNaseⅢ片段化后,利用反转录酶的反转录活性、模板转换活性以及DNA依赖的DNA聚合酶活性,一步实现从RNA到cDNA文库的反应,再通过PCR扩增获得适合测序仪的测序文库,通过测序分析验证建库效果,最后采用荧光定量PCR法测定部分基因的表达量以验证测序结果,同时比较分子条形码的引入对表达量分析的影响。结果:通过电泳观察和测序结果分析,选择Clontech公司的SMARTscribe,反转录和模板转换反应温度设为50℃,反转录完成后经AMPure Beads纯化再经PCR扩增得到测序文库,电泳检测文库DNA长度和浓度符合测序要求。比较发现,用分子条形码建库的测序结果能够更加真实地反应基因的实际表达量。结论:初步建立了针对10 ng RNA样品的RNA-seq建库技术,并在建库方案中加入分子条形码使其测序结果更加真实地反映基因表达量。该技术未来可适用于微量RNA样品的高通量测序。