多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

多重聚合酶链反应一步法用于宫颈病变患者HPV分型检测的初步研究

目的为明确多重聚合酶链反应一步法对宫颈病变患者的细胞学样本中HPV分型检测的有效性。方法研究了从西安交通大学第一附属医院妇产科收集的79例液基细胞学样本。在低度鳞状上皮内病变的患者中,高危型人乳头状瘤病毒(HPV)检测到30.3%,高度鳞状上皮内病变的40.7%,宫颈鳞状细胞癌的43.8%。结果所用样本中均未检测到HPV16感染者,这与HPV16是目前所知最常见的高危型HPV这一结论不相符。结论我们推测出现这一结果可能有两个原因:多重聚合酶链反应一步法这一检测方法在多种引物混合等方面存在漏洞;HPV的分布具有区域性差异。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉

通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8对特异性引物,构建出2个三重和1个二重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明:该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度(melting temperature,Tm)范围分别为反应体系A:73.1~75.2、76.0~77.3、79.0~80.0℃,反应体系B:69.5~72.8、75.0~77.9、78.5~80.0℃,反应体系C:76.1~78.1、79.5~80.7℃;根据3个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。

多重聚合酶链反应-毛细管电泳-激光诱导荧光法检测三种食源性致病菌

建立了食品中常见致病菌大肠杆菌O157：H7的uidA基因、沙门菌的invA基因和志贺菌的ipaH基因的多重聚合酶链反应（PCR）产物的毛细管电泳快速检测方法。根据这3种致病菌的特异性基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增反应体系,采用7.0g/L甲基纤维素为筛分介质,毛细管电泳-激光诱导荧光检测法同时检测了3种常见致病菌的PCR扩增产物。在优化的多重PCR反应和毛细管筛分电泳条件下,该方法可以同时检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7基因的多重PCR扩增产物,22min内即可完成3种常见致病菌的毛细管电泳检测。迁移时间的相对标准偏差为1.47%-2.07%。与凝胶电泳法比较,该法简便快速,灵敏度高,可用于多种致病菌脱氧核糖核酸的检测,为食品安全提供了一种可靠的快速检测方法。

荧光定量聚合酶链反应检测人类乳头瘤病毒在尖锐湿疣中的应用

目的:对尖锐湿疣(CA)患者进行人类乳头瘤病毒(HPV)DNA定量测定及HPV分型。方法:用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对146例CA患者疣体组织进行HPV6.11型和HPV16.18型的分型检测及HPVDNA定量测定。结果:146例CA患者标本中检出HPV6.11和HPV16.18型感染阳性143例(97.95%)。其中单独HPV6.11型阳性104例,占71.24%;单独HPV16.18型阳性16例,占10.96%;HPV6.11和HPV16.18型同时阳性23例,占15.75%;HPV6.11和HPV16.18型同时阴性3例,占2.05%。定量测定结果显示:HPV6.11型患者病毒载量最高1.0×108拷贝/mL,最低2.8×103拷贝/mL,HPV16.18型患者病毒载量最高1.0×108拷贝/mL,最低2.57×104拷贝/mL。结论:CA患者应用FQ-PCR检测HPV阳性率高,并可快速区分高危型及低危型HPV感染,对尖锐湿疣复发及癌变作出可能性预测。

实时荧光定量聚合酶链反应在丙型肝炎诊断中的临床应用价值

目的探讨丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)和丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)荧光定量检测在丙型肝炎诊断中的临床应用价值。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测358例血清中HCV RNA载量及抗-HCV。结果 358例慢性丙型肝炎患者抗-HCV和HCV RNA检出率分别为78.8%和54.2%,经χ2检验差异有统计学意义(P<0.05),HCV RNA的平均载量为4.85×105 copies/mL。结论FQ-PCR检测血清中HCV RNA的载量,是判定HCV感染的直接证据,它反映HCV的活动性和复制程度,有利于抗病毒治疗的疗效观察。抗-HCV和HCV RNA联合检测对丙型肝炎病毒的早期诊断有重要临床应用价值。

荧光定量聚合酶链反应在一期梅毒诊断中的临床意义探讨

为评价荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在一期梅毒诊断中的临床应用价值,以暗视野(D-F)、血清学(RPR/TPHA)检查方法作对照,用FQ-PCR方法检测68例疑诊为一期梅毒病人的生殖器溃疡处分泌物。在68例疑诊为一期梅毒病人中,D-F阳性率27.94%(19/68),RPR阳性率48.53%(33/68),TPHA阳性率61.76%(42/68),FQ-PCR阳性率44.12%(30/68),FQ-PCR与D-F、TPHA比较有显著性差异(P<0.05),与RPR比较无显著性差异(P>0.1)。本研究表明FQ-PCR检测生殖器溃疡TP在一期梅毒诊断中有一定的价值。

荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌的价值

目的分析使用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测结核分支杆菌的应用价值。方法收集首都医科大学附属北京同仁医院临床各科室各类结核病或疑似结核病患者检测标本178例,使用FQ-PCR法进行结核分枝杆菌脱氧核糖核酸检测,标本同时进行抗酸染色显微镜下观察。结果 FQ-PCR法和抗酸染色涂片法对不同来源标本检测结核分枝杆菌的结果存在较好的一致性(Kappa=0.615,P<0.01)。使用FQ-PCR法检测结核分枝杆菌的阳性检出率为12.9%,抗酸染色涂片法的阳性检出率为6.2%,二者比较差别有统计学意义(χ2=4.682,P<0.05)。结论 FQ-PCR法检测标本中的结核分枝杆菌的灵敏度高于传统的抗酸染色涂片法,可作为结核病病原学诊断的优先方法。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

荧光定量聚合酶链反应检测乙肝病毒及其临床意义

目的 :研究HBVDNA含量与乙型肝炎血清学免疫标志物表达关系及HBVDNA含量与肝细胞损害关系。方法 :以完全闭管式的PCR和荧光探针技术相结合的实时检测定量PCR方法 ,对 110例病毒性肝炎患者血清HBVDNA进行检测。结果 :HBeAg阳性 /抗HBe阴性患者HBVDNA拷贝数与HBeAg阴性 /抗HBe阳性患者或HBeAg阴性 /抗HBe阴性患者的拷贝数比较差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而后二者比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;HBVDNA拷贝数与肝实质损害指标血清谷丙转氨酶 /谷草转氨酶 (ALT/AST)、总胆红素 (TBIL)、白蛋白 (ALB)、凝血酶原活动度 (PTA)不具相关性。结论 :抗e抗原抗体非病毒复制终止的标志、病毒性肝炎的肝实质损害程度与血清HBVDNA的含量无相关性。

实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌-DNA对肺结核的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中结核分枝杆菌-DNA(TB-DNA)对肺结核的诊断价值。方法肺结核52例(菌阳20例,菌阴32例),肺炎35例,采用FQ-PCR法检测其支气管肺泡灌洗液中TB-DNA水平。结果52例肺结核组的阳性率为65.4%(菌阳19例,菌阴15例),35例非肺结核组的阳性率为5.7%,经统计学比较,FQ-PCR法检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和培养法(P均<0.05),FQ-PCR法特异性高。结论FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA为痰涂片阴性及无痰患者提供良好的诊断依据。

荧光定量聚合酶链反应技术检测儿童患者人巨细胞病毒结果分析

目的了解本院儿童患者人巨细胞病毒(HCMV)感染现状。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对243例住院疑似患儿进行HCMV-DNA定量检测。结果 HCMV总阳性率为16.05%;男性和女性阳性率分别为17.83%和12.79%;1个月至1岁年龄组(婴儿期)患者最高为17.41%。临床诊断主要以肝损害、腹泻和黄疸为主。结论加强儿童患者HCMV的检测,有助于临床诊断与治疗方案的选择。

荧光定量聚合酶链反应检测GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人骨髓间充质干细胞中的表达

背景：GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在骨髓造血及成脂调控机制中起重要作用。目的：观察GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人间充质干细胞中的表达。方法：收集6例再生障碍性贫血患者及6位正常人骨髓液各10mL,Ficoll贴壁法分离培养骨髓单个核细胞,达70%~80%融合后扩增传代。取传至第3代的间充质干细胞,应用流式细胞仪进行鉴定。提取总RNA,比较各组基因与内参基因之间的差别。荧光定量聚合酶链反应检测GATA-1、GATA-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人间充质干细胞中的表达量。结果与结论：与正常人间充质干细胞相比,再生障碍性贫血患者间充质干细胞的GATA-2和干细胞因子基因表达量降低（P=0.012,0.039）,过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因表达量升高（P=0.035）;两组GATA-1基因表达量差异无显著性意义。提示GATA-2、干细胞因子基因的异常表达可能影响AA患者骨髓微环境的造血调控作用;过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的异常表达可能解释再生障碍性贫血患者骨髓易成脂的原因。

荧光定量聚合酶链反应与分支链DNA信号扩增法检测血清HBV DNA的比较

目的 了解荧光定量聚合酶链反应 (PCR)法与分支链DNA信号扩增 (bDNA)法在检测血清中HBVDNA含量上的优缺点。方法 分别用这两种方法平行检测 44份乙型肝炎患者的血清标本 ,并与定性PCR检测结果比较。同时用荧光定量PCR法观察 15例乙肝患者干扰素治疗期间HBVDNA含量变化。结果 ①荧光定量PCR法和bDNA法比较 ,○a前者测出的HBVDNA含量均值为 ( 3 5 0× 10 5± 3 3 6)copies/μl ;后者为 ( 3 0 7× 10 5± 12 9)copies/μl ,两者比较差异无显著性 (P >0 0 5 )。○b前者的HBVDNA阳性率 79 5 % ;后者及常规PCR定性法均为 5 9 1%。荧光定量PCR法的阳性检出率显著高于bDNA法及常规定性PCR法 (P <0 0 5 )。② 15例中 5例获完全应答的乙型肝炎患者其血清HBVDNA含量在治疗 16周内均逐渐下降至完全转阴。结论 荧光定量PCR法与bDNA法在检测血清HBVDNA含量上 ,结果大多一致 ,且敏感性强 ,检验也较简便、价廉 ,并能较好评价和检测乙肝患者抗病毒疗效 ,宜于临床推广。

荧光定量聚合酶链反应在小儿人巨细胞病毒感染检测中应用

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）在小儿人巨细胞病毒（HCMV）感染检测中的临床应用价值。方法选择2012年1月至2013年10月在武汉市妇女儿童医疗保健中心就诊的疑似HCMV感染患儿血清或尿液标本,其中血清标本454例,尿液标本1 001例,患儿男女比为1 005∶394,年龄1天~3岁。用FQ-PCR检测疑似HCMV感染患儿血清和尿液中的HCMV-DNA,比较两种标本的阳性率。结果 1 001例尿液标本的HCMV-DNA阳性率为46.35%（464/1 001）,显著高于血清标本的阳性率5.95%（27/454）;56例血清和尿液标本HCMV-DNA进行配对检测,其中血清检测阴性的52例中有23例尿液检测为阳性,而血清检测阳性的4例尿液检测均为阳性。结论应用FQ-PCR检测患儿HCMV-DNA,采用尿液标本可提高阳性检出率。

实时荧光定量聚合酶链反应在HBV YMDD基因变异检测中的应用

目的以DNA测序法为标准,探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒YMDD基因变异的敏感性和特异性。方法选取68例乙肝患者经拉米夫定治疗前及治疗9个月后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异,并随机选取10例(5例实时荧光定量PCR提示YMDD变异;5例提示未变异)慢性乙肝患者做DNA测序,分析二者的检测结果。结果拉米夫定治疗前HBVDNA的载量,两组相比差异无统计学意义(P>0.05),9个月后YMDD的变异率为14.7%(10/68);YMDD变异型组HBV DNA无l例阴转,YMDD野生型组HBV DNA阴转率为79.3%(46/58),差异有统计学意义(P<0.01);10例测序法所测结果与实时荧光定量PCR完全相符,总符合率为100.0%。结论实时荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。

实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)对结核性脑膜炎的诊断价值。方法分别采用涂片法、RT-PCR法对结核性脑膜炎、疑似结核性脑膜炎以及非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测,并对检测结果进行比较分析。结果涂片法共检出10例阳性,其中结核性脑膜炎7例(70.00%),疑似结核性脑膜炎3例(30.00%);RT-PCR法共检出46例阳性,其中结核性脑膜炎31例(67.39%),疑似结核性脑膜炎15例(32.61%)。对结核性脑膜炎患者检测,涂片法阳性率(12.28%)低于RT-PCR法阳性率(54.39%),差异有统计学意义(P<0.05);对疑似结核性脑膜炎患者检测,涂片法阳性率(2.91%)低于RT-PCR法阳性率(14.56%),差异有统计学意义(P<0.05);脑脊液涂片法检测结核性脑膜炎的灵敏度为12.28%,漏诊率为87.72%,RT-PCR法检测的灵敏度为54.39%,漏诊率为45.61%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RT-PCR法诊断结核性脑膜炎具有灵敏度好,准确度高等特点,临床有重要的指导意义。

白色念珠菌实时荧光定量聚合酶链反应检测体系的建立

目的建立白色念珠菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测体系,实现白色念珠菌的早期、快速检测,为临床医生对白色念珠菌感染的诊断提供指导。方法使用白色念珠菌及其他真菌标准株,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7设计引物探针。同时对镁离子(Mg2+)、三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、引物及探针浓度等参数进行优化,选出最佳反应体系,并验证反应体系的特异性、重复性,分析反应体系的最低检测限,对临床分离出的45例白色念珠菌进行检测。结果设计的引物探针仅能对白色念珠菌进行特异性扩增,反应体系不同底物浓度与Ct值之间成良好的线性关系,反应体系的最低检测限为5CFU/mL,且反应体系稳定性、重复性好,对临床分离菌株的检测阳性率为100%。结论成功设计了白色念珠菌特异性的引物探针,并建立了实时荧光定量PCR检测体系,能快速、准确地检出白色念珠菌。