一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。

一步法实时荧光定量PCR检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达

目的通过检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达探讨EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强可能的作用机制。方法采用一步法实时荧光定量PCR检测各组大鼠胰腺组织中Insulin基因和PDX-1基因在转录水平的表达。结果大鼠胰腺组织中Insulin mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高;糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.4倍(P<0.05);EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.1倍(P<0.05)。大鼠胰腺组织中PDX-1mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高,糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.8倍(P<0.05),EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.2倍(P<0.05)。结论 EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强的作用机制可能通过其改善胰岛β细胞功能、降低血糖进而减弱糖毒性对PDX-1表达的不良影响,间接地使PDX-1的表达增强。而EGF/Gastrin联用促进胰岛新生、改善胰岛β细胞功能又有可能是通过提高PDX-1的表达而实现的。

登革1型和2型病毒混合感染样本的一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本文旨在建立检测登革1型和2型病毒的一步法实时荧光定量PCR方法,为登革热的诊断和预测提供技术支撑。依据登革1型和2型病毒的保守区序列设计引物和探针,建立了同时检测两个血清型登革病毒的一步法实时荧光定量PCR方法。特异性实验结果显示,该方法可检测出登1型和2型病毒,与登革3型、4型病毒、黄热病毒、流感H3N2病毒均无交叉反应,具有较好的特异性。对登革1型和登革2型的灵敏度均为102copies/μL。应用该方法,可检测出登革1型和2型病毒混合感染C6/36后不同时间点病毒复制动态。在两个血清型登革病毒混合感染C6/36细胞72~120 h登革2型病毒的拷贝数与单独感染时登革2型病毒的拷贝数相比显著下降。上述研究证实建立的一步法实时荧光定量PCR方法具有特异性好灵敏度高、重复性好等特点,能够用于登革型和2型病毒混合感染样本的检测。

基于白纹伊蚊Actin基因参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种以白纹伊蚊Actin基因表达量作为参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测技术,为登革病毒在蚊虫中的定量检测提供更准确的检测方法。根据登革Ⅱ型病毒和白纹伊蚊Actin基因保守区序列设计引物和探针,在检测体系中同时加入病毒和Actin基因的特异性引物,计算每个样本中病毒含量与Actin表达量的比值,得到更为准确的定量结果。该方法重复性好、灵敏度高,可用于实验室白纹伊蚊感染登革Ⅱ型病毒的病毒载量检测。

人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价。结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%。上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份。对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性。本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段。

实时RT-PCR基因表达相对定量REST~软件分析与2^((-ΔΔCT))法比较

目的利用实时RT-PCR技术建立一种简便、准确的基因表达相对定量方法。方法以正常的人支气管上皮细胞株(16HBE)cDNA为模板5倍系列稀释,分别作DNA聚合酶K(POLK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因标准曲线。以不同剂量反式二羟环氧笨并芘(anti-BPDE)诱导的16HBE、anti-BPDE转化的16HBE及肺癌细胞株(H1299)cDNA为模板,进行实时定量RT-PCR。以GAPDH基因作为内参照,进行POLK基因表达相对定量。实验数据分别采用2(-ΔΔCT)法及REST软件分析。结果5倍系列稀释法制作的标准曲线,呈现较好的线型关系(Rsq0.997)。POLK及GAPDH基因扩增效率分别为117.5%和103.5%。采用2(-ΔΔCT)法计算出的表达比值均比REST软件分析高。结论实时RT-PCR技术结合REST软件分析是一种简便、准确的基因表达相对定量分析手段。

用实时荧光定量RT-PCR方法定量绵羊PrP基因的表达

为快速、准确定量绵羊PrP基因的mRNA,建立了绵羊PrP基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法。根据已报道的绵羊PrP基因序列,设计合成引物;采用RT-PCR方法扩增目的片段;构建标准重组质粒制备标准曲线,用于样品检测。结果发现,中枢神经系统组织PrP基因的表达量(copies/ng总RNA,39420)比外周组织(为7845)的高;在中枢神经系统中,脑干的PrP基因的表达量最高(为67020);外周器官中,淋巴结PrP基因的表达量最高(为29086),肾脏的表达量最低(为125)。建立绵羊PrP基因实时荧光定量PCR方法,对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析,为进一步研究绵羊组织器官的PrP表达在传染性海绵状脑病发生中的作用提供基础数据。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

实时荧光定量RT-PCR法检测手足口病患儿大便标本中肠道病毒71型

目的了解2008年手足口病流行期间住院手足口病患儿是否存在EV71病毒感染,并探讨实时荧光定量RT-PCR法对手足口病患儿大便标本中EV71病毒载量进行定量检测的可行性。方法采用RT-PCR荧光探针体外扩增法对47例住院的手足口病患儿大便标本中抽提的RNA进行抽样检测。结果22例(46.81%)手足口病患儿大便标本中EV71的病毒载量大于103copies/ml,最高者达1.03×107copies/ml。实时荧光定量RT-PCR法其标准曲线显示,Ct值与病毒拷贝数的对数(log10)之间的相关系数为1.000,相关性较好。结论2008年手足口病流行期间入住儿科医院的手足口病患儿近半数为EV71病毒感染。实时荧光定量RT-PCR法对大便标本中的EV71RNA定量检测较方便快捷,结果直观,为进一步研究病毒载量与临床表现之间的关系打下了基础。

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测。试验结果显示,所建立的N-ITR二联探针实时荧光定量RT-PCR方法可同步检测PPRV和GTPV,产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)等相关病毒无荧光信号检出。以PPRV-N和GTPVITR的pMD18-T载体质粒为标准品,构建了二联标准曲线,N-ITR探针对PPRV和GTPV的检测敏感度可分别达102和103拷贝/μL。本研究初步建立了可同步快速特异性检测PPRV和GTPV的二联实时荧光定量RT-PCR方法。

实时定量RT-PCR方法评价壬基酚的雌激素效应

壬基酚是1种环境雌激素物质,以血清卵黄蛋白原作为生物标记物检测壬基酚的最低雌激素效应浓度高于10μg/L.利用亚成体青鱼进行不同浓度的(1、10、50、100μg/L)壬基酚暴露实验,运用实时定量RT-PCR方法,从分子水平上,对青鱼VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H和CHG-L的基因表达进行了研究,并对低浓度壬基酚的环境雌激素效应进行了分析.结果表明:1μg/L浓度的壬基酚暴露组青鱼肝脏的VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L基因表达均被显著诱导,说明实时定量RT-PCR能够检测1μg/L壬基酚的环境雌激素效应,具有在现实环境中的应用前景.

西安市景观水体肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测与健康风险评价

根据肠道病毒基因非编码区保守序列的同源性设计肠道病毒通用引物,建立环境水体中肠道病毒的实时定量RT-PCR检测方法,对西安市的主要景观水体进行1 a的连续监测。通过统计分析数据,对肠道病毒感染的健康风险进行评价。结果表明,兴庆湖和北湖的肠道病毒检出浓度符合对数正态分布,浓度随季节变化波动明显,全年浓度几何平均值分别为16.05 copy/L和5.06 copy/L。肠道病毒与细菌总数、大肠菌群、粪大肠菌群等指标均无显著的相关性。根据景观用水的暴露评价和脊髓灰质炎病毒1型、柯萨奇病毒A21和B4型,埃可病毒12型的剂量-反应关系,计算得出兴庆湖和北湖中的各种肠道病毒感染的年风险分别为1.05×10^(-2),1.66×10^(-2),1.47×10^(-2);3.27×10^(-3),5.20×10^(-3),4.59×10^(-3)。结果表明这些景观水体已受到肠道病毒的污染,进一步加强城市景观水体肠道病毒的监测是十分必要的。

水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒，作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品，建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法，从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA，PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段，将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接，转化宿主菌JM-109，提取重组质粒DNA，PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值，确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法，特异性好，检测灵敏度达10^2拷贝，线性范围为10^2-10^7拷贝，阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999），扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品，且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。

应用实时荧光定量RT-PCR法建立肝癌分子诊断指数

目的:筛选肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中表达水平较正常肝细胞差异大、特异性好的基因,建立肝癌分子诊断指数,以期从分子病因学角度实现对肝癌的早期诊断.方法:随机选择38例手术切除组织标本,其中正常肝5例、肝炎4例、肝硬化(LC)12例、HCC和癌旁组织17例,实时荧光定量RT-PCR检测9个基因的表达,以管家基因G3PDH为对照,2-△△CT法计算目的基因相对表达量,依据表达异常的基因个数建立分子诊断指数.结果:GPC3等6个基因在正常肝、肝炎、LC与HCC组的两组或多组间存在差异(P<0.05);GPC3、E2F1从肝炎组到LC、HCC组呈递增趋势,HGF、CLDN10在LC组表达量升高,而在HCC组明显下降,PTEN、PRDM2、MGMT从肝炎组到LC、HCC组呈递减趋势;9个基因在LC组分子诊断指数平均值为1.58,在HCC组平均值为5.24,二者差异显著;GPC3、E2F1、MMP2从癌旁到癌呈递增趋势,CLDN10、HGF、PTEN、DLC1、PRDM2、MGMT从癌旁到癌呈递减趋势.结论:通过筛选更多基因的组合分析,分子诊断指数有望成为鉴别诊断早期肝癌的一种有效方法.

荧光实时定量RT-PCR检测DD3mRNA方法的建立

目的建立荧光实时定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测前列腺癌（PCa）特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法，并进行方法学评价。将PCR扩增产物经凝胶电泳纯化后与pBluescript Ⅱ SK载体连接，再将重组质粒转化感受态细胞进行克隆；提取重组质粒在紫外分光光度计上定量，作为定量检测的标准品。结果重组质粒经PCR扩增及序列测定，表明pBluescriptⅡSK—DD3cDNA克隆成功。PCR扩增产物经测序分析证实为DD3 mRNA特异性片段。本法灵敏度为6拷贝／反应，线性范围为6～6×10^8拷贝／反应，相关系数为0．9985，批内、批间变异系数分别为1.0％～2.0％和1、3％～6、6％。结论成功建立了FQ—RT—PCR检测DD3mRNA的方法。为DD3 mRNA作为前列腺癌的诊断指标提供了方法学依据，也为其他肿瘤基因的检测提供了方法学启示。

实时定量RTPCR监测儿童AML患者AML1/ETO融合基因的临床价值

为了探讨实时定量RT PCR(real timeRT PCR)监测儿童AML患者AML1 ETO融合基因的临床价值 ,筛选出AML1 ETO阳性患儿 14例 ,以连续稀释的AML1 ETO质粒作为标准品建立标准曲线 ,应用实时定量RT PCR监测其初治及随访期 5 8份骨髓中AML1 ETO融合基因 ,用SPSS软件进行统计学分析研究其和临床的关系。结果显示 :实时定量RT PCR监测AML1 ETO基因的敏感度可达 10 - 5,重复性好。 12份初治标本的AML1 ETO∶GAPDH比值平均为 0 .6 4 8,该比值与骨髓中幼稚细胞数的比值无相关性。微小残留白血病 (MRD)定量水平检测发现 ,化疗 1个月时 6例患儿AML1 ETO的量无明显下降 (高于 5× 10 - 2 ) ,其中 3例早期复发 ,1例晚期复发 ;另 4例患儿有明显下降 (低于 10 - 2 ) ,均长期存活。化疗 3个月时 5例高于 5× 10 - 3者中 3例复发 ;另 6例低于 5× 10 - 3者中 1例复发。 6个月后持续高于 10 - 3者 3例均复发。MRD定量水平动态检测发现 ,在化疗中MRD持续在高水平 (>5× 10 - 3)者 4例全部临床复发 ,复发时间在 3个月到半年 ;4例持续低于 10 - 3,维持在 10 - 4- 10 - 6 ,一直处于骨髓缓解期 ;1例化疗中从 10 - 5上升到 10 - 3,5个月后临床复发。 3例持续缓解超过 9个月的患儿仍可检测到融合基因 ,约 10 - 5- 10 - 6 。结论 :实时?

儿童急性髓系白血病WT1基因的实时荧光定量RT-PCR检测及其临床意义

本研究建立实时荧光定量RT-PCR方法检测儿童急性髓系白血病WT1基因(AML)mRNA的表达并探讨其临床意义。采用SYBR G reen I实时荧光定量RT-PCR方法,检测30例初治AML患儿、12例缓解期患儿(30份)、18例复发患儿,30例细胞形态学正常人的骨髓标本中的WT1基因的表达水平,并动态检测20例初治患儿WT1基因的表达。以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算其相对表达量。结果表明:①初治AML患儿WT1基因的表达高于正常对照组和缓解组(p<0.001);缓解AML患儿WT1基因的表达与正常对照组的差异无统计学意义(p>0.05);复发AML患儿WT1基因的表达与初治组的差异无统计学意义(p>0.05);②动态监测儿童AML20例显示,初治时W T1高表达,完全缓解后W T1表达水平下降,复发时W T1表达水平明显升高。20例中5例在临床复发前3-7个月表达水平开始上升。③动态检测的20例患儿初治时W T1阳性组和阴性组完全缓解率(CR)、3年总生存率(O S)无显著差异(p>0.05),治疗后第22-30天的W T1阳性组3年O S显著低于阴性组(p<0.05)。结论:SYBR G reen I实时荧光定量RT-PCR方法是一种快速有效,灵敏度高,特异性好的方法。WT1基因在儿童急性AML中表现为促癌基因的作用,WT1基因表达水平的变化有助于疗效评价,微小残留病的检测和预后判断。

实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌VEGF mRNA的表达

目的建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-timequantitative,RT-PCR)检测乳腺癌患者肿瘤组织VEGFmRNA表达的方法,并验证其与免疫组织化学LSAB方法检测VEGF蛋白表达的相关性。方法提取组织总RNA,逆转录成mRNA,采用实时荧光定量RT-PCR检测44例乳腺浸润性导管癌、25例癌旁正常小叶组织、13例乳腺良性疾病组织中VEGFmRNA表达;采用免疫组织化学LSAB法和彩色图像病理分析系统半定量检测其VEGF蛋白表达。结果乳腺癌组织中VEGFmRNA表达水平显著高于癌旁和良性病组织(P<0.001),而后两者之间无明显差异(P>0.05);VEGF蛋白表达在癌组织,癌旁和良性病组中的分布特点与VEGFmRNA完全一致。结论本研究所建立的用于检测人乳腺组织VEGFmRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化LSAB方法检测的VEGF蛋白表达具有良好相关性,在乳腺癌的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。

鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法，根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法（real-time RT-PCR）。试验以PCR产物为标准品，建立标准曲线，随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12．0～33．0，相关系数为0．997；熔解曲线显示产物为单特异峰，Tm为82．5±0℃；组内变异系数（CV％）为4．26％；纽间试验无显著差异（P〉0．05）。建立的检测鸭IFN-γ mRNA的Real—time RT—PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。