H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达102拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

基因2型鹅星状病毒EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR的建立与应用

目的:建立快速、灵敏、特异的基因2型鹅星状病毒(Goose astrovirus 2,GoAstV-2)检测方法。方法:以GoAstV-2 ORF2基因为靶标,设计特异性检测引物并构建含目标基因的重组质粒作为阳性质粒标准品,以其为模板优化建立一种EvaGreen饱和染料荧光定量一步法RT-PCR检测方法。结果:所建立方法采用dUTP/UDG酶防污染体系,其标准曲线在2.58×10^(1)~2.58×10^(7) copies/μL质粒模板量呈现良好的线性关系,斜率为-3.413,相关系数(R^(2))为0.995,熔解温度T_(M)为(85.5±0.5)℃;该方法对质粒标准品检测灵敏度下限为25.8 copies/μL;该方法特异性检测GoAstV-2,而新城疫病毒(NDV)、H5型禽流感病毒(AIV-H5)、禽呼肠孤病毒(ARV)等11种常见禽传染病病原检测结果均为阴性。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于2%,表明其具有良好的重复性。GoAstV-2感染病死鹅组织定量检测显示,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、小肠、大脑和肌肉组织均可检测出GoAstV-2,其中肾脏病毒含量最高(2.58×10^(11) copies/g),大脑和肌肉组织含毒量较低。32份临床送检病死鹅组织样品的检测显示,9份存在GoAstV-2感染,阳性率为28.1%。结论:EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR能高效检测GoAstV-2,可应用于禽类GoAstV-2感染的诊断和净化检测。

猪腹泻病毒一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析,以PEDV野毒株为模板,对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针,并在两端保守区域设计上下游引物;在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针,并加入简并碱基。同时,分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针,用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化;用RStudio参照代码绘制ROC曲线,确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC,并计算Youden指数,最终确定检测临界值;从阳性核酸中扩增靶基因,并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录,获得5种标准品分别命名为:cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估;并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为:35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×10^(2) copies/μL,标准曲线线性关系良好,扩增效率在96.3%-104%之间;该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.suis)和葡萄球菌(S.aureus)等多种菌毒株均不检出,具有良好的特异性;经重复性检验,组内变异系数在0.22%-3.08%之间,组间变异系数在0.89%-4.0%之间;对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较,符合率分别为:PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外,对临床样本检测结果显示,当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出;但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行,其总体阳性率分别达到:10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242),且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染,使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究,为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR,为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。

一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用

根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。

赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。

鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的DTMUV E基因保守区域设计引物和探针,建立了检测DTMUV的一步法RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法,并比较了两种方法的敏感性和特异性。结果显示,荧光定量RT-PCR标准曲线的相关系数(R^2)为0.999,DTMUV RNA在10~2拷贝/μL^10~7拷贝/μL范围内与Ct值呈现良好的线性关系;两种方法均仅对DTMUV RNA具有特异性扩增,而对其他常见鸭病原核酸的扩增均为阴性,具有较强的特异性;一步法RT-PCR对鸭胚纯培养病毒RNA的检测下限为10~3拷贝/μL,而荧光定量RT-PCR的检测下限为10~2拷贝/μL;重复性试验的变异系数均小于1.5%。对20份模拟临床样品的检测结果表明,一步法RT-PCR的阳性率为75%(15/20),而荧光定量RT-PCR的阳性率为90%(18/20)。本研究表明所建立的DTMUV荧光定量RT-PCR特异性强、重复性好、敏感性更高,更适用于DTMUV的临床诊断和流行病学调查。

实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒

根据番茄环斑病毒 (ToRSV)各株系RNA1聚合酶基因的保守序列 ,设计并合成 1对引物和 1条TaqMan荧光探针 ,建立了对ToRSV的实时荧光RT PCR检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增 ,实现RT PCR扩增与探针检测同时进行 ,不需PCR后处理 ,消除了PCR产物的污染 ,不需电泳和EB染色 ,减少了检测步骤 ,节省了时间。这个方法具有“灵敏、准确、简便、快速”的特点适合于种传病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。

基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的在我国狂犬病均由基因1型狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起。本研究针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和Taqman探针,在优化反应条件的基础上,建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法。方法与结果该方法能特异检测基因1型,不能检测基因2-7型和犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病病毒(CAV)、水泡性口炎病毒(VSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)等5种非狂犬病病原体,其检测灵敏度可达到4.68个TCID50的病毒含量。用该方法对29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品进行检测,并与国际金标准确诊方法狂犬病荧光抗体染色法(FAT)和乳鼠脑内接种试验(MIT)及本实验室建立的套式RT-PCR方法进行比较。结果表明所建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100%,二者均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品,而FAT只检测出12份阳性的新鲜样品和1份阳性的腐败样品,MIT只检测出12份阳性,未检测出阳性腐败样品。检测中FAT和MIT确诊的所有阳性样品在qRT-PCR检测均是阳性,而在FAT检测为阴性的4份腐败样品在qRT-PCR为阳性,说明所建立的qRT-PCR方法准确性达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。结论研究结果表明该qRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、污染率低、操作简单,在我国动物狂犬病临床诊断上具有巨大的应用价值。

一步法实时荧光定量PCR检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达

目的通过检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达探讨EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强可能的作用机制。方法采用一步法实时荧光定量PCR检测各组大鼠胰腺组织中Insulin基因和PDX-1基因在转录水平的表达。结果大鼠胰腺组织中Insulin mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高;糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.4倍(P<0.05);EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.1倍(P<0.05)。大鼠胰腺组织中PDX-1mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高,糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.8倍(P<0.05),EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.2倍(P<0.05)。结论 EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强的作用机制可能通过其改善胰岛β细胞功能、降低血糖进而减弱糖毒性对PDX-1表达的不良影响,间接地使PDX-1的表达增强。而EGF/Gastrin联用促进胰岛新生、改善胰岛β细胞功能又有可能是通过提高PDX-1的表达而实现的。

BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。

传染性胰脏坏死病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是一种严重危害鲑鳟鱼类的重要传染性病原。为建立IPNV快速检测方法,根据IPNV VP2蛋白编码基因保守序列,设计并筛选出特异性引物和Taq Man探针,并优化筛选引物以及探针检测浓度、退火温度和退火时间,建立了一种实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法进行了评价。结果显示:该方法灵敏度高,对IPNV的检测限为5 copies/μL;特异性强,对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、流行性造血器官坏死病毒等其他病毒核酸扩增均呈阴性;重复性良好,组内与组间重复平均变异系数均小于3%;用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法,对40份经病毒分离鉴定的样品进行IPNV检测,符合率为100%。结果表明,本研究建立的方法具有快速、特异、敏感等优点,可检测病毒含量较低的组织样品,对于IPNV的快速检测更具优势。

柯萨奇病毒A组16型TaqMan一步法荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速、灵敏、特异和准确的一步法荧光定量RT-PCR方法用于检测柯萨奇病毒A组16型(Coxsackieviruses A16,CoxA16)。方法根据GenBank登录的CoxA16基因序列,应用生物学软件进行同源性序列比对后,选出CoxA16高度保守且特异的核苷酸区域polyprotein基因,设计特异性引物和TaqMan探针;构建重组质粒作为阳性标准品,建立检测CoxA16的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果成功建立了CoxA16的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,该方法最低检测限为101个拷贝/μL,与常规PCR相比,敏感性提高100倍。组内和组间重复性实验的变异系数小于2%。该检测方法特异性强,与肠道病毒71型、柯萨奇病毒B组5型、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒75型、登革热病毒、霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157均不发生交叉反应。结论本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于CoxA16感染的日常检测和实验室早期快速诊断。

一步法实时荧光RT-PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用

目的建立一种能快速检测甲型流感病毒的一步法实时荧光PCR方法,对样本进行准确检测。方法以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,建立一步法实时荧光RT-PCR方法,并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒1、2、3型以及季节性流感病毒H1、H3进行检测,验证该方法的特异性和灵敏度,并对临床样本进行检测应用。结果所建立的一步法实时荧光RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增,操作方便快速,对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01TCID50/ml;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%。结论本研究建立的一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测,有助于对临床流感病例的快速诊断。

登革1型和2型病毒混合感染样本的一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本文旨在建立检测登革1型和2型病毒的一步法实时荧光定量PCR方法,为登革热的诊断和预测提供技术支撑。依据登革1型和2型病毒的保守区序列设计引物和探针,建立了同时检测两个血清型登革病毒的一步法实时荧光定量PCR方法。特异性实验结果显示,该方法可检测出登1型和2型病毒,与登革3型、4型病毒、黄热病毒、流感H3N2病毒均无交叉反应,具有较好的特异性。对登革1型和登革2型的灵敏度均为102copies/μL。应用该方法,可检测出登革1型和2型病毒混合感染C6/36后不同时间点病毒复制动态。在两个血清型登革病毒混合感染C6/36细胞72~120 h登革2型病毒的拷贝数与单独感染时登革2型病毒的拷贝数相比显著下降。上述研究证实建立的一步法实时荧光定量PCR方法具有特异性好灵敏度高、重复性好等特点,能够用于登革型和2型病毒混合感染样本的检测。

PEDV和TGEV双重TaqMan荧光定量一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

本文通过对猪腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)基因组生物信息学分析,分别在两种病毒基因保守区设计特异性探针和Real-Time PCR引物,并建立了检测PEDV和TGEV的双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,本研究建立的方法对其他常见病毒无交叉检出,具有较强的特异性;应用本方法对PEDV和TGEV检测灵敏度均可达101个拷贝。应用本法组装PEDV和TGEV双重实时荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒批次内、批次间的变异系数CV(coefficient of variation,CV)分别低于0.58%和3.7%。应用该试剂盒对97份病例进行检测,阳性率提高了14.93%。本研究建立的一步法荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高、定量且重复性和稳定性好等优点,在PEDV和TGEV感染的快速鉴别诊断,以及流行病学调查方面都有广阔的应用前景。

基于白纹伊蚊Actin基因参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种以白纹伊蚊Actin基因表达量作为参照的登革Ⅱ型病毒一步法实时荧光定量PCR检测技术,为登革病毒在蚊虫中的定量检测提供更准确的检测方法。根据登革Ⅱ型病毒和白纹伊蚊Actin基因保守区序列设计引物和探针,在检测体系中同时加入病毒和Actin基因的特异性引物,计算每个样本中病毒含量与Actin表达量的比值,得到更为准确的定量结果。该方法重复性好、灵敏度高,可用于实验室白纹伊蚊感染登革Ⅱ型病毒的病毒载量检测。

一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立

为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法.