一氧化碳释放分子2对心肺复苏大鼠复苏后肠屏障功能的影响

目的:探讨一氧化碳释放分子2(CORM-2)对心肺复苏(CPR)后大鼠肠黏膜上皮屏障功能的影响。方法:采用冰氯化钾停跳联合窒息4 min、人工胸外心脏按压3 min的方法建立大鼠心脏骤停(CA)-CPR后肠缺血再灌注损伤模型。32只健康雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组、CPR组、CORM-2组及灭活型CORM-2(i CORM-2)组,每组8只。假手术组仅置入相关导管,不行CPR术,其余各组均置入相关导管并经历CA-CPR。假手术组使用4 m L/kg生理盐水、CPR组使用4 m L/kg 2%二甲基亚砜、CORM-2组及i CORM-2组使用4 mg/kg相应干预药物,于术前12 h腹腔注射。各组复苏(或置管)后连续监测4 h血流动力学,并于复苏(或置管)后4 h留取回肠组织及血清。HE染色及透射电镜观察回肠组织病理形态及超微结构。ELISA法测定血清肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)含量。Western blot检测回肠组织紧密连接蛋白claudin-3、occludin和ZO-1及促炎因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果:假手术组和复苏各组之间置管后即刻平均动脉压(MAP)的变化差异均无统计学显著性;CPR组、CORM-2组和i CORM-2组复苏后各时点MAP均明显低于置管后即刻,并持续至复苏后4 h(P <0.05);复苏各组复苏后各时点MAP均显著低于假手术组置管术后同一时点MAP(P <0.05);CORM-2组复苏后各时点MAP均显著高于CPR组及i CORM-2组(P <0.05)。CPR组大鼠肠道组织病理形态和超微结构损伤严重;CORM-2组大鼠肠黏膜病理形态和超微结构完整性明显优于其它复苏各组。与假手术组比较,CPR组和i CORM-2组的I-FABP水平明显升高(P <0.05);CORM-2组的I-FABP水平与假手术组比较差异无统计学显著性,但显著低于CPR组及i CORM-2组(P <0.05)。与假手术组比较,CPR组和i CORM-2组的claudin-3、occludin和ZO-1蛋白表达均降低(P <0.05),CORM-2组仅claudin-3和ZO-1蛋白表达降低(P <0.05);CORM-2组上述蛋白表达均高于CPR组及i CORM-2组(P <0.05)。与假手术组比较,CPR组和i CORM-2组的促炎因子TNF-α蛋白表达均升高(P <0.05);CORM-2组TNF-α蛋白表达与假手术组比较差异无统计学显著性,但显著低于CPR组及i CORM-2组(P <0.05)。结论:心脏骤停-心肺复苏可造成大鼠肠机械屏障损伤。CORM-2可上调肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白表达,降低肠黏膜通透性,从而有效维持心肺复苏大鼠肠屏障完整性。

外源性一氧化碳释放分子2对脓毒症大鼠肺炎症反应的抑制作用及分子机制

目的:观察外源性一氧化碳释放分子2(carbon monoxide-releasing molecules-2,CORM-2)干预对脓毒症大鼠肺部炎症反应的抑制作用并探讨其机制。方法:24只雄性SD大鼠随机分为假手术组、CLP组和CLP+CORM-2组。采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法建立脓毒症模型,用CORM-2进行干预,苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;放射免疫法检测血浆中TNF-α和白细胞介素(IL-1β、IL-6)的变化;ELISA法检测肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量,蛋白质印迹法检测肺组织核因子-κB(NF-κB)蛋白的表达情况。结果:与假手术组相比,CLP模型组主要表现为肺组织微血管通透性增加,肺泡壁增厚,间质水肿,白细胞浸润,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显增加,ICAM-1含量明显增高,NF-κB表达水平明显增加(P均<0.01);CLP+CORM-2组肺间质轻度水肿,白细胞少量浸润,炎症因子的表达增加,ICAM-1含量增高,NF-κB表达水平增加(P均<0.05)。与CLP模型组比较,CLP+CORM-2组肺间质水肿程度减轻,白细胞浸润明显减少,炎症因子水平显著下降,ICAM-1含量下降,NF-κB表达水平明显下降(P均<0.05)。结论:CDRM-2可显著抑制脓毒症大鼠肺部炎症反应,其可能机制为CORM-2可有效地减弱NF-κB的表达。

外源性一氧化碳释放分子2对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用研究

目的探讨外源性一氧化碳释放分子2(CORM2)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用与相关机制。方法将30只健康雄性Wistar大鼠分为实验组、对照组、空白组,每组各10只。实验组在造模前1h尾静脉注射外源性CORM2。实验组和对照组采用相同的方法造模。对照组造模后1h注射与实验组相同剂量的生理盐水。空白组仅完成开腹和关腹操作,并术后1h注射与实验组相同剂量的生理盐水。在术后不同时间进行神经行为学评分(Tarlov评分)、脊髓组织病理学检查和白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测。结果再灌注后不同时间点,实验组Tarlov评分均高于对照组,但实验组和对照组Tarlov评分均低于空白组(P<0.05)。缺血再灌注48h后,对照组脊髓组织标本可见损伤及坏死神经元,表现为细胞核固缩或溶解,细胞质中的尼氏体消失;空白组脊髓组织标本中可见正常神经元,表现为结构呈多角形,细胞质中可见尼氏体;实验组脊髓组织标本中的神经元坏死表现介于对照组和空白组之间。缺血再灌注48h,实验组与对照组IL-6、TNF-α表达水平均高于空白组,但实验组IL-6、TNF-α表达水平低于对照组(P<0.05)。结论外源性CORM2可抑制炎性因子的表达,对大鼠脊髓缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

外源性一氧化碳释放分子2对脓毒症小鼠肝脏能量代谢的调控作用及机制

目的:观察脓毒症小鼠肝脏能量代谢的变化,同时探讨外源性一氧化碳释放分子2(carbon monoxide-releasing molecules-2,CORM-2)对其调控及作用机制。方法:将48只C57BL/6小鼠随机均分成对照组,盲肠结扎穿孔(CLP)组,CORM-2组,无活性CORM-2(inactivated CORM-2,iCORM-2)组。采用CLP术制作脓毒症模型,对照组不作任何处理,CORM-2组和iCORM-2组除术后使用CORM-2或无活性CORM-2外,其余处理同CLP组,术后72 h内连续监测各组12只小鼠血糖浓度的动态变化及存活情况。另选32只小鼠分组同上,术后24 h收集肝脏组织及血浆,检测肝组织的18F-FDG分布、葡萄糖激酶活性、乳酸含量,全自动生化分析仪检测血浆丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST)。结果:与对照组比较,CLP组葡萄糖代谢水平增强,葡萄糖激酶、AST、ALT活性以及乳酸含量均明显增高(P均<0.05);CORM-2干预后上述指标明显降低(P均<0.05)。与对照组比较,各手术组小鼠血糖在术后36 h内持续下降,且组间差异无统计学意义。结论:CORM-2能明显减少脓毒症小鼠肝18F-FDG摄取、葡萄糖激酶活性和乳酸含量,从而改善脓毒症小鼠肝脏能量代谢紊乱,提高生存率。

外源性一氧化碳释放分子2体外干预内毒素／脂多糖致健康人血小板过度活化的研究

目的探讨外源性一氧化碳释放分子2（CORM-2）对LPS所致健康人外周血中血小板过度活化的作用及分子机制。方法采集1名健康成年人的静脉血，离心分离出富血小板血浆（PRP），分装于硅化后的试管，按随机数字表法分为正常对照组、LPS组、无活性CORM-2（iCORM-2）组、10μmol／LCORM-2组、50μmol／LCORM-2组，每组3管。正常对照组不进行任何处理；LPS组接受20mL10μg／mL的LPS刺激；iCORM-2组、10μmol／LCORM-2组、50μmol／LCORM-2组在接受上述LPS刺激的同时分别接受50μmol／LiCORM-2、10μmol／LCORM-2、50μmol／LCORM-2的干预，用量均为20mL。培养30min后玻瓶法检测血小板黏附率；免疫荧光法检测血小板侵袭至纤维蛋白原的数量；比浊法检测血小板聚集率；取PRP制备贫血小板血浆（PPP）及血小板，化学荧光素法检测PPP及血小板内ATP含量；流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白（GP）Ibα和GPVI表达；蛋白质印迹法、免疫沉淀法分别检测血小板糖原合酶激酶3p（GSK-3β）及磷酸化GSK-3β表达。以上指标均重复测定3次。对数据行单因素方差分析、SNK检验。结果与正常对照组比较，LPS组、iCORM-2组PRP中血小板黏附率、侵袭至纤维蛋白原上的血小板数量、血小板聚集率、血小板GPIbα和GPVI表达量及PPP中ATP含量均明显增加，血小板内ATP含量均明显减少，P值均小于0．05。与LPS组比较，iCORM-2组上述各指标无明显变化（P值均大于0．05）；10μmol／LCORM-2组、50μmol／LCORM-2组血小板内ATP含量明显增加，其余上述各指标均明显减少，P值均小于0．05。正常对照组、LPS组、iCORM-2组、10μmol／LCORM-2组、50μmol／LCORM-2组PRP中血小板GSK-3β表达量分别为0．550．4-0．060、1．4374-0．214、1．2104-0．108、0．720±0．010、0．6704-0．010，磷酸化GSK-3β表达量分别为0．9504-0．070、1．6074-0．121、1．4204-0．040、1．1674-0．015、0．5134-0．122。LPS组、iCORM-2组PRP中血小板GSK-3β表达量及磷酸化GSK-3β表达量较正常对照组明显增加（P值均小于0．05），iCORM-2组PRP中血小板GSK-3β表达量及磷酸化GSK-3B表达量与LPS组相近（P值均大于0．05），10μmol／LCORM-2组、50μmol／LCORM-2组PRP中血小板GSK-3β表达量及磷酸化GSK-3β表达量较LPS组明显减少（P值均小于0．05）。结论LPS刺激可致健康人外周血中血小板异常活化，CORM-2的干预能够有效地抑制血小板的过度活化，其机制可能涉及GP介导的GSK-3β的磷酸化。

一氧化碳释放分子2对休克大鼠肠黏膜上皮屏障的保护作用

目的探讨一氧化碳释放分子-2(CORM-2)对休克肠屏障损伤的保护作用。方法采用Wiggers改良法制备失血性休克大鼠模型,32只SD大鼠随机(随机数字法)分为4组:假手术组、休克组、CORM-2组及iCORM-2组(灭活型CORM-2组),每组各8只。CORM-2组及iCORM-2组干预药物均为5mg/kg制作休克模型前1h腹腔注射;各组于术后或制作休克模型24h后留取回肠组织观察病理形态及超微结构;Western-blot检测回肠组织ZO-1、Occludin、Claudin3蛋白表达;ELISA法测定血D-乳酸及TNF-α含量。各组间采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,方差不齐时采用Kruskal Wallis秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)休克组大鼠回肠黏膜病理形态和超微结构损伤明显。CORM-2可明显改善休克大鼠肠黏膜病理形态和超微结构完整性。(2)与假手术组比较,休克组和iCORM-2组的Claudin3、Occludin、ZO-1蛋白表达均降低(均P<0.05),CORM-2组仅Claudin3、ZO-1蛋白表达降低(均P<0.05)。CORM-2组上述蛋白表达均高于休克组及iCORM-2组(均P<0.05)。(3)与假手术组比较,休克组和iCORM-2组血D-乳酸及TNF-α水平明显升高[D-乳酸(ng/mL)分别为139.49±28.83,135.75±25.19vs65.09±33.16;TNF-α(pg/mL)分别为358.60(314.18,395.73),312.25(275.75,345.40)vs65.85(47.82,84.32),均P<0.05]。CORM-2组血D-乳酸及TNF-α水平有升高趋势,但差异无统计学意义[D-乳酸(ng/mL)75.65±34.14vs65.09±33.16;TNF-α(pg/mL)104.00(93.10,131.95)vs65.85(47.82,84.32),均P>0.05]。CORM-2组血D-乳酸及TNF-α水平均低于休克组和iCORM-2组(均P<0.05)。结论CORM-2可减轻休克肠屏障损伤,并上调肠上皮紧密连接蛋白表达,其抗炎效应可能是其发挥保护作用的机制之一。

外源性一氧化碳释放分子2对脓毒症时Janus激酶/信号转导和转录激活子通路活化的抑制作用

目的 了解外源性一氧化碳释放分子2（CORM2）对脓毒症时Janus激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）信号通路活化的抑制作用.方法 将RAW264.7细胞分为正常对照组、LPS（10 μg/mL LPS,浓度下同）组、LPS＋无活性CORM-2组、LPS＋小剂量CORM-2（50 μmol/LCORM-2）组、LPS＋大剂量CORM-2（100μmol/L CORM-2）组,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α的水平及蛋白质印迹法检测JAK1、JAK3分子磷酸化水平.另将35只雄性BALB/c小鼠按随机数字表法分为正常对照组、盲肠结扎和穿孔术（CLP）组、CLP＋无活性CORM-2（8.0 mg/Kg）组和CLP＋CORM-2（8.0 mg/kg）组.CLP＋CORM-2组除伤后使用CORM-2外,其他处理同CLP组.于伤后24 h按上述方法检测小鼠血浆TNF-α、IL-1β的表达水平以及肝组织JAK1、JAK3分子磷酸化水平.对数据行t检验.结果 与正常对照组[（1.9±0.3）pg/mL]比较,LPS组细胞的TNF-α水平明显升高[（8.2±2.7）pg/mL,t=2.844,P〈0.01],磷酸化JAK1、JAK3蛋白水平也升高;2种剂量LPS＋CORM-2组细胞的TNF-α,水平分别为（5.7±1.4）、（3.2±0.9）pg/mL,较LPS组明显下降（t值分别为2.104、2.363,P值均小于0.05）,JAK1、JAK3分子的磷酸化水平呈浓度依赖性下降.与正常对照组比较,CLP组血浆TNF-α、IL-1β水平明显升高（t值分别为2.916、2.796,P值均小于0.01）,小鼠肝组织JAK1、JAK3分子的磷酸化水平亦明显升高.CLP＋CORM-2组TNF-α、IL-1β血浆水平显著降低（t值分别为2.115、2.398,P值均小于0.05）,肝组织JAK1、JAK3蛋白的磷酸化得到有效抑制.结论 CORM-2能明显抑制JAK分子磷酸化,继而抑制JAK/STAT信号通路的活化,减少下游相关细胞因子的表达,有效防止严重感染时炎症反应的级联反应.

外源性一氧化碳释放分子2体外干预对内毒素/脂多糖刺激人中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用及其机制

目的 探讨外源性一氧化碳释放分子2（CORM-2）对LPS刺激人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的作用及其机制. 方法 采集1名健康成年志愿者的静脉血,分离出中性粒细胞后,按随机数字表法分为正常对照组、LPS组、LPS＋ 10 μmol/L CORM-2组、LPS＋ 50 μmol/L CORM-2组、LPS＋无活性CORM-2（iCORM-2）组.正常对照组不进行任何处理;LPS组采用1μL 1μg/mL的LPS刺激;LPS＋ 10 μmol/L CORM-2组、LPS＋ 50 μmol/L CORM-2组、LPS＋ iCORM-2组在采用上述相同剂量LPS刺激的同时,分别采用10 μmol/L CORM-2、50 μmol/L CORM-2、50 μmol/L iCORM-2各1μL进行干预,常规培养1h后检测相关指标.用碘化丙啶染色标记法检测NET数量,流式细胞仪检测细胞早期凋亡率,二氢罗丹明123荧光探针法检测活性氧生成水平（结果以平均荧光强度表示）,蛋白质印迹法检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达水平.每组以上4个实验样本数均为5.对数据行单因素方差分析、SNK检验. 结果 （I）LPS组和LPS＋ iCORM-2组细胞每400倍视野下NET数量与正常对照组相近（P值均大于0.05）.LPS＋10 μmol/L CORM-2组和LPS＋50μmol/L CORM-2组细胞每400倍视野下NET数量较正常对照组和LPS组均明显增多（P值均小于0.05）.LPS＋ iCORM-2组细胞每400倍视野下NET数量与LPS组相近（P＞0.05）.（2）LPS组、LPS＋ 10 μmol/L CORM-2组、LPS＋ 50 μmol/LCORM-2组、LPS＋ iCORM-2组细胞早期凋亡率较正常对照组明显增加（P值均小于0.05）,LPS＋10 μmol/L CORM-2组、LPS＋ 50 μmol/L CORM-2组、LPS＋ iCORM-2组细胞早期凋亡率与LPS组相近（P值均大于0.05）.（3）LPS组、LPS＋ 10 μmol/LCORM-2组、LPS＋ iCORM-2组细胞活性氧生成水平高于正常对照组（P值均小于0.05）,LPS＋50 μmol/L CORM-2组细胞活性氧生成水平与正常对照组相近（P＞0.05）.LPS＋10 μmol/LCORM-2组和LPS＋ 50μmol/L CORM-2组细胞活性氧生成水平明显低于LPS组（P值均小于0.05）,LPS＋ iCORM-2组细胞活性氧生成水平与LPS组相近（P＞0.05）.（4） LPS组和LPS＋ iCORM-2组细胞磷酸化ERK1/2表达水平分别为0.031 1±0.001 4和0.030 9±0.0018,与正常对照组的0.030 4±0.004 6相近（P值均大于0.05）;LPS＋ 10 μmol/L CORM-2组和LPS＋ 50 μmol/L CORM-2组细胞磷酸化ERK1/2表达水平分别为0.789 1±0.020 1和1.297 0±0.005 6,高于正常对照组（P值均小于0.05）.LPS＋ 10 μmol/L CORM-2组、LPS＋ 50 μmol/L CORM-2组细胞磷酸化ERK1/2表达水平高于LPS组（P值均小于0.05）,LPS＋ iCORM-2组细胞磷酸化ERK1/2表达水平与LPS组相近（P＞0.05）. 结论 CORM-2干预可以明显增加LPS刺激后NET的形成,其机制可能与CORM-2抑制活性氧生成和促进ERK1/2磷酸化有关.

一氧化碳释放分子2对心肺复苏大鼠复苏后心功能保护作用的研究

目的探讨一氧化碳释放分子2(CORM-2)对心肺复苏(CPR)大鼠复苏后心功能是否具有保护作用及其机制。方法健康雄性SD大鼠40只(共55只,其中复苏失败10只,血流动力学监测过程中死亡5只),体重320~370 g,随机数字表法分为假手术组、CPR组、DMSO组、灭活型CORM-2组(iCORM-2组)和CORM-2组,每组8只。采用冰氯化钾停跳联合窒息4 min,然后进行人工胸外心脏按压3 min,建立大鼠心脏骤停-心肺复苏(CA-CPR)模型。假手术组大鼠仅置入相关导管,不进行CA-CPR相关建模操作,置管前12 h腹腔注射0.9%的生理盐水(4 ml/kg);CPR组大鼠CPR术前12 h腹腔注射0.9%的生理盐水(4 ml/kg);CORM-2组大鼠CPR术前12 h腹腔注射CORM-2溶液(4 mg/kg);DMSO组大鼠CPR术前12 h腹腔注射DMSO溶液(4 ml/kg);iCORM-2组大鼠CPR术前12 h腹腔注射灭活的CORM-2溶液(4 mg/kg)。各组大鼠在复苏/置管后连续监测血流动力学参数4 h(时间点分别为复苏/置管后即刻,复苏/置管后0.5、1、2、3、4 h),包括平均动脉压(MAP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)及下降速率(-dp/dt)。复苏/置管后4 h留取大鼠心肌组织及血清,透射电镜下观察心肌超微结构,乳酸-丙酮酸法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)活性,酶联免疫吸附法测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)浓度,Western blot法检测心肌组织Caspase-3、9和胞浆细胞色素C(Cyt-C)蛋白表达水平。结果 CPR组、DMSO组、iCORM-2组和CORM-2组复苏后0.5、1、2、3和4 h大鼠的MAP、+dp/dtmax、-dp/dt均较置管后即刻有所降低(P均<0.05)。CPR组、DMSO组和iCORM-2组复苏后0.5、1、2、3和4 h大鼠的MAP均低于假手术组相应时间点(P均<0.05),而CORM-2组与假手术组比较差异则均无统计学意义(P均>0.05)。CPR组、DMSO组和iCORM-2组复苏后0.5、1、2、3和4 h大鼠的+dp/dtmax和-dp/dt均低于假手术组相应时间点,但仅在0.5、1和2 h时差异有统计学意义(P均<0.05),而CORM-2组与假手术组比较差异则均无统计学意义(P均>0.05)。CORM-2组大鼠复苏后4 h心肌组织超微结构完整性明显优于其余各组。CPR组、DMSO组和iCORM-2组大鼠复苏后4 h血清中LDH活性和CK-MB浓度均明显高于假手术组置管后4 h(P均<0.01)。CORM-2组大鼠仅血清中CK-MB高于假手术组(P<0.01),LDH活性虽略高但差异无统计学意义(P>0.05)。CORM-2组大鼠血清中LDH活性和CK-MB浓度均明显低于CPR组、DMSO组和iCORM-2组(P均<0.01)。CPR组、iCORM-2组和DMSO组大鼠复苏后4 h心肌组织Caspase-3、9和胞浆Cyt-C蛋白表达水平均明显高于假手术组(P均<0.05),CORM-2组仅Caspase-3、9蛋白表达水平明显高于假手术组(P均<0.05),胞浆Cyt-C蛋白表达水平与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。CPR组、iCORM-2组和DMSO组大鼠心肌组织Caspase-3、9和胞浆Cyt-C蛋白表达水平均明显高于CORM-2组(P均<0.05)。结论 CORM-2对CPR大鼠复苏后心功能具有保护作用,而保护心肌线粒体、减少线粒体途径介导的细胞凋亡可能是其机制之一。

外源性一氧化碳释放分子2对大肠杆菌活力及毒力的作用

目的 探讨外源性一氧化碳释放分子2（CORM-2）对大肠杆菌ATCC 25922菌株活力及毒力的作用及可能机制。方法 （1）体外实验1。将菌株按照随机数字表法分为细菌组、细菌＋1.2 mmol/L CORM-2组、细菌＋1.6 mmol/L CORM-2组、细菌＋1.2 mmol/L无活性CORM-2（iCORM-2）组、细菌＋1.6 mmol/L iCORM-2组,每组样本数为6。细菌组不添加任何物质，其余4组添加相应浓度的CORM-2或iCORM-2。于培养0、3、5、8、10、12、16、20、24、27、30、48 h，测定各组菌液的增殖活性，结果以吸光度值（波长为600 nm）表示；同时进行菌落计数。（2）体外实验2。另取菌株，将其分为细菌组和细菌＋0.8 mmol/L CORM-2组，采用基因芯片筛查出大肠杆菌的4个相关基因fliA、dnaK、marA和waaQ进行实时定量PCR（qRT-PCR），检测各基因表达量。（3）在体研究。另取菌株同体外实验1分组及处理，培养至细菌组菌液的吸光度值（波长600 nm）为0.4时，各组收集0.5 mL菌液。将72只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为空白对照组、细菌组、细菌＋1.2 mmol/L CORM-2组、细菌＋1.6 mmol/L CORM-2组、细菌＋1.2 mmol/L iCORM-2组、细菌＋1.6 mmol/L iCORM-2组，每组12只。空白对照组小鼠不行任何处理，其余5组小鼠取对应有或无添加物的0.5 mL菌液进行腹腔注射。注射后对后5组小鼠进行大体观察。注射后6、12 h检测后5组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平，注射后12 h收集小鼠肝、肺组织标本检测髓过氧化物酶（MPO）活性。空白对照组小鼠行相同检测。对数据进行重复测量设计方差分析、析因设计方差分析、单因素方差分析和t检验。结果 （1）体外实验1。与细菌组和细菌＋1.2 mmol/L iCORM-2组比较，细菌＋1.2 mmol/L CORM-2组多数时相点细菌增殖活性明显受抑，菌落明显数量减少（F值分别为1170.80、217.52，P值均小于0.01）；与细菌组和细菌＋1.6 mmol/L iCORM-2组比较，细菌＋1.6 mmol/L CORM-2组多数时相点细菌增殖活性亦明显受抑，菌落数量亦明显减少（F值分别为7948.34、14 432.85，P值均小于0.01）。（2）体外实验2。qRT-PCR检测结果显示：与细菌组比较，细菌＋0.8 mmol/L CORM-2组fliA基因表达下调，dnaK、marA和waaQ基因表达上调（t值分别为30.28、-165.54、-168.88、-187.28，P值均小于0.01）。（3）在体研究。细菌组和细菌＋1.2 mmol/L iCORM-2组、细菌＋1.6 mmol/L iCORM-2组小鼠出现诸如精神萎靡、呼吸急促等症状，细菌＋1.2 mmol/L CORM-2组、细菌＋1.6 mmol/L CORM-2组小鼠上述症状轻微或不明显。注射后6 h，细菌组、细菌＋1.2 mmol/L iCORM-2组小鼠血清TNF-α、IL-6水平分别为（647.3±3.8）pg/mL、（3.44±0.22）ng/mL以及（639.3±0.8）pg/mL、（2.47±0.32）ng/mL，明显高于细菌＋1.2 mmol/L CORM-2组［（124.6±10.7）pg/mL、（1.03±0.16）ng/mL，t值为15.22~84.03，P值均小于0.01］。与细菌组和细菌＋1.6 mmol/L iCORM-2组比较，注射后6、12 h细菌＋1.6 mmol/L CORM-2组小鼠血清TNF-α、IL-6水平亦均明显降低（t值为19.27~245.34，P值均小于0.01）。注射后12 h，细菌＋1-2 mmol/L CORM-2组小鼠肝、肺组织中MPO活性明显低于细菌组、细菌＋1.2 mmol/L iCORM-2组，细菌＋1.6 mmol/L CORM-2组小鼠肝、肺组织中MPO活性亦明显低于细菌组、细菌＋1.6 mmol/L iCORM-2组（t值分别为17.36~18.92、2.35~3.61，P值均小于0.01）。结论 CORM-2能够明显抑制大肠杆菌的活力和毒力，其抑制作用可能与其调节大肠杆菌部分重要的靶基因（fliA、dnaK、marA和waaQ）有关。

一氧化碳释放分子-2对小鼠急性肝功能衰竭保护作用的实验研究

目的探讨一氧化碳释放分子-2对小鼠急性肝功能衰竭(ALF)的保护作用及机制。方法雄性C57BL/6小鼠30只随机分为对照组、模型组和保护组,每组10只。通过一次性腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)构建小鼠ALF的动物模型,CORM-2于造模前30 min行尾静脉注射,造模后6 h分别留取血清、肝组织标本。生化分析仪检测血清中ALT、AST水平,HE观察肝脏病理改变,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-α和IL-6的水平,反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中TNF-α和IL-6 mRNA的表达。结果保护组小鼠血清ALT[(1274.60±157.24)U/L比(3499.00±136.19)U/L]和AST[(1151.50±244.58)U/L比(4079.50±481.11)U/L]水平均明显低于模型组(均t1=33.81,t2=17.16,P<0.05);与模型组比较,保护组肝组织炎性细胞浸润明显减少,肝细胞坏死程度明显减轻[(0.14±0.05)比(0.37±0.05),t=10.29,P<0.05];保护组小鼠血清和肝组织中TNF-α[(139.60±28.39)pg/mL比(447.34±128.17)pg/mL、(0.31±0.03)比(0.69±0.05)]和IL-6[(215.21±85.16)pg/mL比(1461.58±244.90)pg/mL、(0.33±0.03)比(0.72±0.05)]表达水平明显低于模型组(均t1=7.41,t2=20.61,t3=15.20,t4=21.15,P<0.05)。结论 CORM-2能够抑制小鼠ALF时的炎性反应,减轻肝脏病理损伤,其机制可能与抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的释放有关。

一氧化碳释放分子2调控T淋巴细胞分化介导抗炎保护失血性休克大鼠肠屏障

目的探讨一氧化碳释放分子2(carbon monoxide-releasing molecule-2,CORM-2)调控T淋巴细胞的分化介导抗炎保护失血性休克大鼠肠屏障。方法56只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、休克组、二甲基亚砜组(dimethyl sulfoxide,DMSO)、灭活型一氧化碳释放分子2组(inactive carbon monoxide-releasing molecule-2,iCORM-2)、CORM-22 mg/kg组、CORM-24 mg/kg组及CORM-26 mg/kg共7组,每组8只。采用Wiggers改良法制备失血性休克大鼠模型,CORM-2各剂量组和iCORM-2组于制备休克模型前即刻腹腔注射不同剂量CORM-2和6 mg/kg iCORM-2,DMSO组腹腔注射与iCORM-2等量的2%DMSO,休克组和假手术组不给予药物干预。各组大鼠记录置管后或休克后不同时相平均动脉压变化。各组大鼠造模成功后23 h采用荧光素异硫氰酸酯(fliorescein isothiocyanate,FITC)-葡聚糖作为渗透性标记物测试肠壁通透性,并留取回肠组织观察肠道病理形态。免疫组化观察大鼠肠黏膜淋巴细胞转录因子T-bet、Foxp3的表达,Western Blot检测大鼠肠黏膜组织干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达。正态分布计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析,非正态分布数据采用Kruskal Wallis秩和检验。结果与假手术组相比,休克组、DMSO组和iCORM-2组血清中FITC-葡聚糖浓度明显增加(均P<0.05);与休克其余各组比较,CORM-2各剂量组血清中FITC-葡聚糖浓度均减低(均P<0.05)。病理学改变显示休克组、DMSO组和iCORM-2组大鼠回肠组织损伤明显;CORM-2干预可减轻休克大鼠回肠黏膜损伤,且CORM-24 mg/kg组和CORM-26 mg/kg组回肠结构更完整。休克组和DMSO组肠黏膜淋巴细胞T-bet抗原表达较假手术组升高(均P<0.05);CORM-2各剂量组T-bet抗原表达较休克组降低(均P<0.05)。CORM-22 mg/kg组、CORM-24 mg/kg组及iCORM-2组Foxp3抗原表达较休克组和DMSO组均减低(均P<0.05),但CORM-26 mg/kg组与休克组或DMSO组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。与假手术组相比,休克组IFN-γ表达升高(P<0.05),IL-10和TGF-β表达未见差异(均P>0.05);与休克组相比,CORM-2各剂量组IL-10蛋白表达升高(均P<0.05),其中CORM-24 mg/kg组和CORM-26 mg/kg组TGF-β表达上调(均P<0.05),但仅CORM-26 mg/kg组较休克组IFN-γ表达下调(P<0.05)。结论CORM-2可抑制1型辅助性T细胞的活化,降低炎症因子,增加抗炎因子,减轻休克缺血肠壁炎症,保护肠屏障。

外源性一氧化碳释放分子对体外培养PC12细胞的谷氨酸兴奋性神经毒性

目的探讨一氧化碳释放分子2(CORM-2)对PC12细胞谷氨酸信号通路的影响及作用机理,揭示急性一氧化碳中毒迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)发生的可能机制,为CO的中毒及其后遗症的防治提供实验依据。方法以高分化的PC12细胞为研究对象,经不同浓度的CORM-2暴露后,用MTS法检测细胞活力,确定合适的染毒浓度及染毒时间,收集细胞后用蛋白免疫印迹法检测N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体主亚基(NR1)及NMDA受体2B亚基(NR2B)蛋白的表达,检测细胞内钙离子浓度及细胞释放的谷氨酸含量,用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果随着CORM-2浓度的增加,PC12细胞的活力呈剂量依赖性降低(P<0.05);各剂量与对照组相比,NMDA受体的NR1亚基的表达未发生显著的变化(P>0.05),250μmol/L和300μmol/L剂量组NR2B蛋白的相对表达水平以及Ca^(2+)浓度、谷氨酸水平均高于对照组和200μmol/L剂量组(P<0.05);随着CORM-2浓度的增加,PC12细胞的凋亡率也呈剂量依赖性增加(P<0.05)。结论随着COMR-2浓度的增加,PC12细胞的活力呈剂量依赖性降低。CORM-2可使PC12细胞谷氨酸信号通路激活。CORM-2可能通过激活谷氨酸信号通路引起Ca^(2+)内流,进而导致细胞凋亡。这些结果对认识CO中毒机制具有重要意义。

一氧化碳释放分子-2对复苏后心功能的影响

目的探讨一氧化碳释放分子-2（CORM-2）对大鼠复苏后心功能不全可能的保护机制。方法建立致颤法建立大鼠心肺复苏模型，健康雄性SD大鼠随机（随机数字法）分为模型（Control）组、CORM-2组、无活性CORM-2（iCORM-2）组和假手术（Sham）组，复苏成功后分别静脉注射等体积（1mL）0．2％DMSO溶液、50μmol／kgCORM-2、50μmol／kgiCORM-2及0．2％DMSO溶液。复苏后12h心脏彩超测量射血分数（EF）和心肌功能指数（MPI）评估心功能，Clark氧电极测定心肌线粒体呼吸，Western blot检测心肌胞浆及线粒体蛋白细胞色素c（cytc）及caspase-3表达。组间比较采用方差分析。结果与Control组比较，复苏后12hCORM-2组EF增高，MPI降低，线粒体Ⅲ态呼吸速率、呼吸控制率（RCR）增高，胞质caspase．3及胞质／线粒体cytc比例降低（P〈0．05）。iCORM-2组上述指标与Control组比较，组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论CORM-2可能通过释放CO，抑制心肌线粒体途径细胞凋亡改善线粒体呼吸功能及复苏后心功能不全。

一氧化碳释放分子-2对脓毒症大鼠心肌功能障碍的影响

目的探讨一氧化碳释放分子-2(CORM-2)对脓毒症大鼠心肌功能障碍的保护作用。方法将140只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型组、CORM-2预处理组、灭活型一氧化碳释放分子-2(iCORM-2)预处理组、二甲基亚砜(DMSO)对照组5组,每组28只。腹腔注射10 mg/kg脂多糖(LPS)建立大鼠脓毒症模型;Sham组腹腔注射等量生理盐水(NS)。CORM-2和iCORM-2预处理组分别于注射LPS前1 h腹腔注射8 mg/kg CORM-2或iCORM-2,DMSO对照组腹腔注射等量DMSO;Sham组和模型组不给予其他处理。各组分别抽取20只大鼠观察10 d存活率。剩余8只大鼠于制模后12 h行超声心动图检查,并计算左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS);取下腔静脉血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)和脑钠肽(BNP)水平;之后处死大鼠取心肌组织,观察心肌病理形态学和超微结构改变。结果①生存情况:Sham组大鼠全部存活;与Sham组比较,模型组、CORM-2预处理组、iCORM-2预处理组和DMSO对照组大鼠10 d存活率均明显降低〔10%(2/20)、70%(14/20)、25%(5/20)、15%(3/20)比100%(20/20),均P<0.01〕;但CORM-2预处理组10 d存活率明显高于模型组、iCORM-2预处理组和DMSO对照组(均P<0.01)。②心功能:与Sham组比较,模型组、CORM-2预处理组、iCORM-2预处理组、DMSO对照组大鼠LVEF、LVFS均明显降低,且超声心动图提示左心室扩张明显,存在心肌功能障碍;但CORM-2预处理组大鼠LVEF、LVFS均明显高于模型组、iCORM-2预处理组和DMSO对照组〔LVEF:0.760±0.029比0.634±0.021、0.629±0.066、0.673±0.023;LVFS:(39.32±2.38)%比(29.75±1.52)%、(29.61±4.15)%、(32.43±1.66)%,均P<0.05〕,超声心动图提示CORM-2预处理后脓毒症大鼠左心室扩张程度明显减轻。③心肌损伤标志物:与Sham组比较,模型组、CORM-2和iCORM-2预处理组、DMSO对照组大鼠血清cTnI、BNP水平均明显升高;但CORM-2预处理组cTnI、BNP水平均较模型组、iCORM-2预处理组、DMSO对照组明显降低〔cTnI(ng/L):3283.54±803.50比6449.18±1105.10、5919.21±1068.27、6349.80±1153.08;BNP(ng/L):3456.62±905.85比6070.18±1287.62、5581.13±1161.17、5974.89±988.89,均P<0.05〕。④心肌组织病理学观察:模型组、iCORM-2预处理组、DMSO对照组光镜下显示大鼠心肌组织病理形态损伤严重,透射电镜下显示线粒体肿胀,部分出现空泡状改变;CORM-2预处理组心肌病理形态学及超微结构完整性明显优于脓毒症其余各组。结论CORM-2可改善脓毒症大鼠心肌功能障碍,提高大鼠存活率,尤其可保护脓毒症心肌线粒体完整。

一氧化碳释放分子-2对乳腺肿瘤大鼠肠屏障损伤的影响

目的观察一氧化碳释放分子-2(CORM-2)对乳腺肿瘤大鼠肠屏障损伤的影响。方法选取60只雌性SD大鼠为研究对象,采用随机数字表法分为假手术组、乳腺肿瘤组、CORM-2组、灭活型CORM-2(iCORM-2)组,各15只。CORM-2组和iCORM-2组均在制作乳腺肿瘤模型1 h前腹腔注射5 mg/kg干预药物。制作模型或术后24 h留取回肠组织,蛋白质印迹法(Western blot)检测回肠组织的咬合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白(Claudin3)表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血D-乳酸、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、二胺氧化酶(DAO)、髓过氧化物酶(MPO)水平,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测小肠黏膜Rho激酶-1 mRNA、ROCK-2 mRNA。分析CORM-2对乳腺肿瘤大鼠肠屏障损伤的影响,应用SPSS 22.0统计软件分析。结果乳腺肿瘤组、iCORM-2组大鼠的Occludin(0.07±0.01、0.13±0.02)、ZO-1(0.09±0.03、0.12±0.02)、Claudin3(0.21±0.03、0.24±0.06)蛋白表达均低于假手术组(0.35±0.04、0.49±0.05、0.64±0.07)和CORM-2组](0.33±0.03、0.23±0.04、0.42±0.05),CORM-2组的ZO-1、Claudin3蛋白表达水平低于假手术组,差异有统计学意义(t=2.389、2.186、2.801,P<0.05)。乳腺肿瘤组、iCORM-2组大鼠的血D-乳酸[(138.28±29.37)、(135.78±20.93)μg/L]、TNF-α[(354.32±23.39、314.43±21.17)ng/L]、I-FABP(585.63±119.34、548.37±132.38)水平均高于假手术组和CORM-2组(65.30±23.19、75.29±32.11),(65.48±10.92、103.28±19.92),(230.19±38.27、306.28±19.22),CORM-2组大鼠的血D-乳酸、TNF-α、I-FABP、MPO水平均高于假手术组,差异有统计学意义(t=2.549、2.495、2.858,P<0.05)。4组大鼠的血DAO水平比较差异无统计学意义(t=2.252,P>0.05)。乳腺肿瘤组、CORM-2、iCORM-2组大鼠小肠黏膜Rho激酶-1 mRNA(1.03±0.04、3.27±0.07、2.21±0.05)、ROCK-2 mRNA(0.78±0.08、2.24±0.12、2.17±0.17)均高于假手术组(2.85±0.08、2.36±0.08),CORM-2组大鼠的小肠黏膜Rho激酶-1 mRNA低于乳腺肿瘤组和iCORM-2组,差异有统计学意义(F=7.831、8.427、4.997,P<0.05)。乳腺肿瘤组、CORM-2、iCORM-2组大鼠的小肠黏膜ROCK-2 mRNA比较差异无统计学意义(F=1.605,P>0.05)。结论CORM-2可缓解乳腺肿瘤大鼠的肠屏障损伤,抑制炎性介质释放,增强肠上皮细胞间的紧密联系,增大肠黏膜通透性,保护肠屏障。

抑郁诱导过程中腹腔注射CORM-2大鼠的抑郁症状、海马神经元活性、脑组织炎性因子基因表达观察

目的目的观察抑郁诱导过程中,腹腔注射一氧化碳释放分子2(CORM-2)对诱导大鼠的抑郁症状、海马神经元活性及脑组织炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达变化的影响,并探讨其可能作用机制.方法SPF级健康雄性SD大鼠48只,随机分为CO干预组、生理盐水组、诱导组、正常组,每组12只.CO干预组、生理盐水组、诱导组大鼠每天选择禁食、45°笼倾斜、冰水游泳、束缚活动等慢性刺激中的1~2种,连续进行抑郁诱导21 d诱导.CO干预组、生理盐水组分别在诱导前1天腹腔注射CORM-2及生理盐水10 mg/kg,后每7天腹腔注射1次,至诱导第21天共注射3次.正常组大鼠饲养于正常标准条件下不作任何处理.分别于诱导前、诱导第21天观察各组大鼠一般情况(体质量、食量、饮水量),诱导第21天采用糖水偏好实验评估各组大鼠快感缺失程度,旷场实验观察大鼠行为能力.诱导第21天各组随机选取5只大鼠,处死后取脑组织海马组织,尼氏染色后观察海马组织CA1区神经元活性.诱导第21天时取各组剩余大鼠,处死后取脑组织(包含海马组织),实时荧光定量PCR法检测脑组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA.结果与正常组比较,诱导组、生理盐水组和CO干预组大鼠体质量、食量和饮水量均降低(P均<0.05);与诱导组和生理盐水组比较,CO干预组大鼠体质量、食量和饮水量均增加P均<0.05).与正常组比较,诱导组、生理盐水组和CO干预组大鼠糖水偏好率、水平活动格数和垂直活动次数均降低(P均<0.05);与诱导组和生理盐水组比较,CO干预组大鼠糖水偏好率、水平活动格数和垂直活动次数均升高(P均<0.05);CO干预组、生理盐水组、诱导组及正常组大鼠海马组织CA1区神经元存活率分别为61.7%±9.0%、50.8%±9.3%、50.4%±8.2%、72.1%±12.1%,与正常组比较,诱导组、生理盐水组和CO干预组海马组织CA1区神经元存活率降低(P均<0.05),与诱导组、生理盐水组比较,CO干预组海马组织CA1区神经元存活率升高(P均<0.05).与正常组比较,诱导组、生理盐水组和CO干预组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA相对表达量均升高(P均<0.05);与诱导组和生理盐水组比较,CO干预组大鼠脑组织中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA相对表达量均降低(P均<0.05).结果抑郁诱导过程中腹腔注射CORM-2诱导大鼠的抑郁症状改善,海马组织CA1区神经元活力更高,脑组织炎性因子表达降低.CORM-2可通过减少大鼠海马组织神经元损伤,降低脑组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达等途径改善抑郁诱导大鼠的抑郁症状.

CORM-2抑制HMGB1释放减轻肾脏缺血再灌注损伤

目的：探讨一氧化碳释放分子2（CORM-2）在小鼠缺血再灌注损伤中发挥保护作用及其作用机制。方法：建立小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,给予CORM-2、重组高迁移率族蛋白1（rHMGB1）对小鼠肾脏缺血进行干预治疗,检测肾脏缺血再灌注后24h血肌酐、血尿素氮,评价肾脏功能情况。并对小鼠血浆中高迁移率族蛋白1（HMGB1）水平进行检测分析。结果：小鼠肾脏经历热缺血再灌注后出现明显肾功能损害（IRI组vs sham组,P〈0.05）,然而,给予CORM-2治疗能显著降低血浆肌酐和尿素氮升高水平,肾功能得到显著保护（CORM-2组vs IRI组、iCORM-2组,P〈0.05）。并且,在肾脏缺血再灌注过程中,CORM-2可以明显减少血浆HMGB1水平,显著抑制了HMGB1的核浆迁移释放,减轻缺血再灌注损伤,发挥保护肾脏功能作用。然而,输注外源性rHMGB1能显著逆转了CORM-2的保护作用（rHMGB1组vs CORM-2组,P〈0.05）。结论：在缺血再灌注损伤过程中,CORM-2通过抑制HMGB1核浆迁移释放下调炎症反应,从而减轻缺血再灌注损伤发挥保护效应。