人肝细胞中砷代谢产物分析表征研究

采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用技术对染砷后Chang肝细胞中的砷代谢产物进行分析。通过参考文献及相关实验推测出两种未知砷代谢产物,并采用标准合成加入法证明其中一种未知砷代谢产物为一甲基亚胂酸(MMAⅢ)。定量分析结果显示,随着染砷浓度的增大,细胞中的一甲基砷、二甲基砷以及无机砷含量均呈现增大趋势,而甲基化率却呈现减小趋势,这说明高浓度砷对细胞甲基化能力有抑制作用。

砷及其代谢物对BEAS-2B细胞p53基因表达影响

[背景]砷是人类致癌物。砷及其代谢物会影响p53表达,但砷及其代谢物处理人正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)后,p53磷酸化及泛素化水平的变化尚不清楚。[目的]探讨砷及其代谢物一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA)对BEAS-2B细胞中抑癌基因p53表达的影响。用不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)染毒细胞,利用CCK-8试剂检测细胞活力,确定NaAsO2染毒BEAS-2B细胞的剂量和时间。基于细胞活力结果,将细胞分为两组,即不同浓度亚砷酸钠组和砷甲基化代谢产物组,不同浓度亚砷酸钠组染毒剂量分别为0、2、4、6μmol·L^(-1)NaAsO2;砷甲基化代谢产物组包括0μmol·L^(-1)NaAsO2(对照组)、6μmol·L^(-1)MMA组、6μmol·L^(-1)DMA组和6μmol·L^(-1)NaAsO2组。48 h收集细胞,提取总蛋白和总RNA,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测p53 mRNA相对表达水平,采用免疫共沉淀和蛋白质免疫印迹法检测p53泛素化水平,通过蛋白免疫印迹法检测p53蛋白、p53 Ser9和Ser15位点磷酸化蛋白的相对表达水平。[结果]在BEAS-2B细胞中,与对照组相比,不同浓度NaAsO2染毒后,细胞存活率均降低(P<0.05),并且NaAsO2浓度在6μmol·L^(-1)时细胞存活率约为50%。与对照组相比,不同浓度的NaAsO2(2、4、6μmol·L^(-1))处理后p53 mRNA相对表达水平呈逐渐降低趋势,差异具有统计学意义(P<0.05);不同浓度的NaAsO2诱导p53蛋白、Ser9位点磷酸化蛋白相对表达水平均逐渐降低(P<0.05);不同浓度的NaAsO2诱导p53 Ser15位点磷酸化蛋白相对表达水平均呈逐渐降低趋势,但仅6μmol·L^(-1)NaAsO2组低于对照组且差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,MMA组和DMA组p53 mRNA、p53蛋白、Ser9和Ser15位点磷酸化蛋白相对表达水平无明显影响。与对照组相比,NaAsO2染毒后,p53泛素化表达水平明显下降,K48位点泛素化表达水平下降。[结论]砷引起BEAS-2B细胞p53蛋白表达降低主要由于其磷酸化途径被抑制和mRNA表达降低,p53泛素化水平减少所致的蛋白变化未占主导作用。MMA和DMA对p53基因表达无影响。

亚砷酸钠及其代谢产物对A549细胞中环状基因表达的影响

分别用浓度为20、40、60μmol/L的亚砷酸钠(NaAsO_(2))溶液和无机砷的代谢产物一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)对处于对数生长期的人肺腺癌A549细胞处理48 h,提取RNA并逆转录为cDNA,用聚合酶实时荧光定量反应(qRT-PCR)检测hsa_circ_0004448、hsa_circ_0027493、hsa_circ_0000416、circRELB、circFOXN2、circATXN2 6个环状基因(circRNAs)的相对表达量。结果表明,与对照组比较,不同浓度的NaAsO_(2)溶液均可引起A549细胞中上述circRNAs表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,DMA仅使hsa_circ_0004448和circATXN2表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。经MMA染毒后,上述6个circ-RNAs的相对表达量均无变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与NaAsO_(2)组比较,MMA组和DMA组中6个circRNAs表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

慢性饮水型砷暴露人群尿砷代谢模式及影响因素分析

目的:分析吉林和山西省高水砷暴露地区人群尿砷代谢产物,探讨不同人群砷代谢模式和可能的影响因素。方法:2018年10月至2019年8月,采用整群抽样方法,以山西省吕梁市和吉林省白城市部分乡(镇)的饮水砷含量超标村(水砷≥0.05 mg/L)为调查采样点,选择饮用当地集中式供水和小井水的35岁以上常住居民作为砷暴露组,以临近饮食居住习惯相同、经济条件相近的低砷水源地区人群为对照组,开展流行病学调查和一般健康状况检查。采集两组人群尿样,用液相色谱-原子荧光光谱仪(LC-AFS)技术分离和检测4种形态砷化合物,包括三价无机砷(iAs^(Ⅲ))、五价无机砷(iAs^(Ⅴ))、一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)。计算总砷(tAs)、无机砷百分比(iAs%)、MMA百分比(MMA%)、DMA百分比(DMA%)、甲基化率(PMI)和二甲基化率(SMI)。采用多元线性回归分析砷代谢的影响因素。结果:共调查1415名村民,其中砷暴露组1256人,对照组159人;对照组与砷暴露组年龄、性别比例、职业分布情况比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),而吸烟、饮酒、体质指数(BMI)和受教育程度分布情况比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。对照组和砷暴露组尿tAs、iAs%、MMA%、DMA%、PMI和SMI中位数(M)分别为12.86μg/L、15.03、5.23、76.35、84.97、93.68和69.68μg/L、10.24、8.37、79.31、89.76、90.65,砷暴露组尿tAs、DMA%和PMI水平均高于对照组,而iAs%和SMI均低于对照组(U=-13.87、-4.30、-6.64、-6.64、-1.99,P均<0.05)。对人群尿砷代谢影响因素分析发现,年龄和BMI是iAs%的影响因素(β=-0.08、-0.08,P均<0.05);性别、饮酒、BMI和受教育程度是MMA%的影响因素(β=-0.11、-0.09、-0.07、0.08,P均<0.05);年龄、性别、BMI和受教育程度是DMA%的影响因素(β=0.06、0.09、0.10、-0.09,P均<0.05);年龄和BMI是PMI的影响因素(β=0.08、0.08,P均<0.05);性别、饮酒、BMI和受教育程度是SMI的影响因素(β=0.09、0.08、0.08、-0.09,P均<0.05)。结论:不同砷暴露人群尿砷代谢模式存在差异,年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI以及受教育程度可能是不同砷代谢模式的影响因素。

砷及其主要代谢产物对A549细胞凋亡及促凋亡基因Bad和Bik表达的影响

目的探讨砷及其主要代谢产物对人肺腺癌细胞系A549细胞凋亡及促凋亡基因Bad和Bik表达的影响。方法于2020年10月,复苏培养A549细胞,利用细胞计数试剂CCK-8检测细胞活力,确定亚砷酸钠(NaAsO_(2))染毒A549细胞的浓度和时间。研究分为NaAsO_(2)染毒组和代谢产物染毒组:NaAsO_(2)染毒组染毒剂量为0(对照组)、20、40、60μmol/L;代谢产物染毒组包括60μmol/L一甲基胂酸(MMA)染毒组、60μmol/L二甲基胂酸(DMA)染毒组。采用Hoechst33342/碘化丙啶双染法(Ho/PI)观察细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测染毒后细胞Bad和Bik mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Bad蛋白、磷酸化Bad(P-Bad-S112)蛋白、Bik蛋白、裂解Bik蛋白及下游蛋白多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP1)和细胞色素C(Cyt-C)的相对表达情况,采用分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)3、6、8、9的活性变化。结果与对照组比较,20、40、60μmol/L NaAsO_(2)染毒组凋亡细胞占比明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,2.0、4.0、6.0μmol/LNaASO_(2)染毒组Bad mRNA表达水平、Bik mRNA表达水平升高,Bad蛋白、磷酸化Bad蛋白、Bik蛋白、裂解Bik蛋白、PARP1蛋白、Cyt-C蛋白相对表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Caspase 3、6、8、9活性明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,DMA染毒组Bad mRNA表达水平为1.439±0.173,差异有统计学意义(P=0.024),Bik mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.788);MMA染毒组Bad和Bik mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.085、0.063)。与对照组比较,MMA染毒组Bad、Bik、PARP1、Cyt-C蛋白相对表达量(0.696±0.023、0.707±0.014、0.907±0.031、1.032±0.016)差异无统计学意义(P=0.469、0.669、0.859、0.771);DMA染毒组Bad、Bik、PARP1、Cyt-C蛋白相对表达量(0.698±0.030、0.705±0.022、0.908±0.015、1.029±0.010)差异均无统计学意义(P=0.479、0.636、0.803、0.984)。结论NaAsO_(2)可通过引起Bad和Bik蛋白过表达,启动磷酸化Bad的负反馈调节以及Bik的降解,激活下游蛋白PARP1、Cyt-C和Caspase途径,介导A549细胞凋亡。

砷及其代谢产物对A549细胞Bax和Bak基因表达的影响

目的探讨无机砷及其主要代谢产物对A549细胞中的Bax和Bak基因表达的影响。方法以不同浓度(0、20、40和60μmol/L)亚砷酸钠(NaAsO_(2))和60μmol/L一甲基胂酸(methylarsonicacid,MMA)、60μmol/L二甲基胂酸(dimethylarsenate,DMA)染毒A549细胞48 h,采用凋亡与坏死细胞绿色荧光探针和C1056细胞凋亡与坏死检测试剂盒双重染色,倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡和坏死情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Bax和Bak的蛋白表达情况,荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测Bax和Bak的mRNA表达情况。结果观察细胞凋亡与坏死情况,同对照组比较,各NaAsO_(2)染毒组凋亡和坏死增加,且随剂量增加,凋亡和坏死增加。Western blot结果显示,同对照组相比,不同浓度的NaAsO_(2)染毒组Bax和Bak的蛋白表达量均升高(P<0.01),且NaAsO_(2)与Bax、Bak蛋白表达量之间存在明显剂量反应关系;MMA和DMA均可使Bax的蛋白表达量增加,但MMA和DMA可使Bak蛋白表达降低。QRT-PCR结果显示,各NaAsO_(2)染毒组Bax和Bak的mRNA表达同对照组相比明显升高(P<0.05);MMA可促进Bax的mRNA表达(P<0.05),但DMA对Bax的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);MMA和DMA对Bak的mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论NaAsO_(2)促进A549细胞中Bax和Bak基因蛋白的表达,但其主要代谢产物对Bax和Bak的影响与NaAsO_(2)相比存在差异。

砷及其代谢物对BCL-2基因转录本BCL-2α和BCL-2β表达的影响

[背景]砷是一种毒物,会影响细胞抗凋亡基因BCL-2及其蛋白质的表达,但砷对BCL-2不同亚型转录本BCL-2α和BCL-2β的影响尚无相关报道。[目的]研究砷及其代谢物一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA)对人正常支气管上皮样细胞(16HBE)和人肺腺癌细胞(A549)中BCL-2基因转录本BCL-2α、BCL-2β及其总和BCL-2T的影响。[方法]将16HBE细胞和A549细胞经体外培养后随机分成3大组:等浓度的不同砷化合物(MMA、DMA和亚砷酸钠)单独染毒组(16HBE细胞的处理浓度为4.5μmol·L^(-1),A549细胞为60μmol·L^(-1)),不同浓度的亚砷酸钠单独染毒组(16HBE细胞的处理浓度为1.5、3.0、4.5μmol·L^(-1),A549细胞为20、40、60μmol·L^(-1))以及联合染毒组(即MMA+亚砷酸钠、DMA+亚砷酸钠;16HBE细胞的染毒浓度分别均为1.5μmol·L^(-1)和均为4.5μmol·L^(-1),A549细胞的染毒浓度分别均为20μmol·L^(-1)及60μmol·L^(-1)),同时在各染毒组中均设立空白对照组。持续染毒48 h后采用实时荧光定量PCR检测两种细胞中BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的相对表达情况。[结果]不同砷化合物单独染毒:16HBE细胞在4.5μmol·L^(-1)MMA处理下,BCL-2α和BCL-2T的表达水平均低于对照组(q=3.27、2.93,均P<0.05),在4.5μmol·L^(-1)亚砷酸钠处理下BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平均低于各自对照组(q=11.06、3.65、10.70,均P<0.05)。A549细胞在60μmol·L^(-1)DMA处理下BCL-2T的表达水平低于对照组(q=3.12,P<0.05),在60μmol·L^(-1)亚砷酸钠处理下BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平均低于各自对照组(q=7.59、7.27、8.06,均P<0.05)。亚砷酸钠单独染毒:16HBE细胞在1.5μmol·L^(-1)亚砷酸钠处理下,BCL-2α的表达水平低于对照组,BCL-2β的表达水平高于对照组(q=6.06、11.92,均P<0.05);在3.0μmol·L^(-1)亚砷酸钠处理下,BCL-2α的表达水平低于对照组(q=12.72,P<0.05);在4.5μmol·L^(-1)亚砷酸钠处理下,BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平均低于各自对照组(q=15.72、6.79、6.62,均P<0.05)。BCL-2α的表达水平随亚砷酸钠浓度升高逐渐下降(F_(α趋势)=144.80,P<0.001),BCL-2β和BCL-2T则在1.5~4.5μmol·L^(-1)范围内呈剂量依赖性降低(F_(β趋势)=135.40,F_(T趋势)=38.24,均P<0.001)。在各浓度亚砷酸钠处理下A549细胞BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平均低于各自对照组(均P<0.05);且进一步趋势检验结果显示,BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平均随亚砷酸钠浓度增加逐渐下降(F_(α趋势)=31.97,F_(β趋势)=549.50,F_(T趋势)=252.40,均P<0.001)。联合染毒:在均为60μmol·L^(-1)的MMA+亚砷酸钠处理下,A549细胞BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平均高于对照组(q=6.37、14.91、5.33,均P<0.05);在均为60μmol·L^(-1)的DMA+亚砷酸钠处理下,A549细胞BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平也均高于各自对照组(q=8.60、17.29、6.91,均P<0.05)[结论]高浓度(16HBE:4.5μmol·L^(-1);A549:60μmol·L^(-1))的砷代谢产物单独染毒对16HBE及A549细胞的BCL-2转录本多无影响。低浓度(1.5μmol·L^(-1))的亚砷酸钠单独染毒可降低16HBE细胞BCL-2α的表达水平,升高其BCL-2β的表达水平;各浓度亚砷酸钠单独染毒可降低A549细胞中所有转录本的表达水平。高浓度(60μmol·L^(-1))的MMA与亚砷酸钠联合染毒以及高浓度(60μmol·L^(-1))的DMA与亚砷酸钠联合染毒均会升高A549细胞中BCL-2α、BCL-2β和BCL-2T的表达水平,与单独染毒呈现的效应不同。