双抗体夹心酶联免疫方法检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌

丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌可以引起十字花科细菌性黑斑病,是侵染萝卜、白菜、花椰菜等农作物的重要病害之一。以灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌(NCPPB1820)为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤细胞技术,筛选最终获得6株产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与抗体偶联,作为检测探针,分别将6种单克隆抗体作为包被抗体,进行两两配对筛选。结果表明,所制备的抗体特异性较好,对水稻细菌性谷枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种均没有交叉反应。以6号抗体作为检测抗体(6-HRP),以1号抗体作为包被抗体,建立酶联免疫分析法获得了最佳的敏感度。检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种的最低检测限为1.5×105cfu/m L,定量限为4.12×105cfu/m L。基于双抗体夹心的酶免疫方法特异性好,便捷,可以实现对丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌高通量测定。

拟南芥果胶甲酯化酶基因PME17在抵御丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株中的功能

细胞壁是植物抵御病原菌入侵的第一道屏障,果胶是细胞壁初生壁的主要组分。果胶甲酯化酶(PME)是修饰果胶的主要酶之一,它在合成细胞壁、调节其弹性和通透性等过程中发挥重要作用。拟南芥基因表达数据库显示,PME17等多个果胶甲酯化酶基因在病原菌侵染情况下强烈表达。本文研究了PME17的组织表达及其在丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株(Pst DC3000)侵染过程中的功能。结果表明,在未受Pst DC3000侵染的条件下,PME17基因在主根、根毛、子叶、叶毛、花粉等部位表达;在受Pst DC3000感染时,PME17表达显著增强。和野生型相比,pme17突变体对Pst DC3000侵染更加敏感,说明拟南芥PME17基因的表达受Pst DC3000的诱导,并在防御Pst DC3000侵染中起积极作用。

MLST技术分析中国烟草野火病菌遗传多样性

明确烟草野火病菌多位点序列分型(MLST)情况,能为制订有效防治措施和选育品种提供强力技术支撑,并为病菌的生物学特性研究提供新视角。从湖南、重庆等5个产烟省(市)烟草生产区采集烟草野火病样,组织分离并鉴定,应用MLST分型,筛选管家基因,分析供试菌株遗传多样性。结果表明,从湖南等5个产烟省(市)分离获得烟草野火病菌144株,筛选得到Pgi、Pfk和Gap 3个管家基因,共获得92个ST型。以Pgi基因为标准,供试菌株可分出亚群5个,单一群4个,亚群1和亚群2菌株数量较多,亚群1菌株来自5个产烟省(市),此亚群的ST43属于中国主要种群。说明中国烟草野火病菌遗传多态性丰富,烟草品种与病菌组群间不存在关联性。

低温等离子活化水对猕猴桃溃疡病菌抗菌活性及机制

为了探究低温等离子体活化水(cold plasma activated water,PAW)对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,PSA)的抗菌活性和潜在机制。该研究通过介质阻挡放电(dielectric barrier discharge,DBD)低温等离子体发生装置制备不同激活时间的PAW,考察放电时间与杀菌效果之间的关系。此外,通过评估PSA形态特征,细胞粒径、DNA、细胞膜损伤情况和胞内活性氧积累(reactive oxygen species,ROS)情况探究PAW对PSA的杀菌机制。结果表明:PAW对PSA的杀灭效果与PAW激活时间呈依赖性,与对照相比PAW处理120 s后,PSA显著(P<0.05)减少了4.38 lg CFU/mL。扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)结果清楚地表明,由于PAW处理,PSA细胞发生了明显的质壁分离。荧光染色结果显示,PSA细胞DNA、膜渗透屏障被破坏程度、内容物泄漏量和ROS积累量与PAW激活时间表现为正相关关系。因此,推测PAW由于自身酸性、较高的氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP),以及水性活性物质导致细胞的氧化损伤,而且这可能是杀灭PSA的主要原因。研究结果可为PAW控制猕猴桃细菌性溃疡病提供参考。

番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

1998～ 1999年在吉林省、辽宁省、黑龙江省等地的大棚番茄上发现一种番茄病害 ,并从其病叶、病茎杆上分离得到了 2 3个细菌菌株。接种番茄幼苗上 ,发病症状与自然发病症状完全一致 ,并从接种病株上重新分离到此病原细菌。各菌株致病力无明显的差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、G+ C mol%等鉴定 ,确认该病原菌为丁香假单胞杆菌番茄致病变种 (Pseu-domonas syringae pv.tomato(Okabe) Young,Dye & Wilkie)。该病菌引起番茄细菌性斑点病 (又称叶斑病 )。病菌除侵染番茄外 ,尚能侵染茄子、辣椒、龙葵、白花曼陀罗和毛曼陀罗。该病害尚属我国大陆首次报道。

福建省番茄细菌性斑点病的病原鉴定

2006年在福建省闽清县种植的反季节番茄上发现一种细菌病害,从病叶和茎杆上共分离到15个细菌菌株,经柯赫氏法则证明均能在番茄上引起相同症状病害,而且从接种病株上又重新分离到了相同细菌.这15个菌株致病力均无明显差异.经革兰氏染色、培养性状、生理生化特性、16S rRNA基因序列等鉴定,确认为丁香假单胞杆菌番茄致病变种.寄主范围测定的结果表明,该病菌除侵染番茄外,人工接种尚能侵染茄子.

香料烟细菌性斑点病病原鉴定

2004～2005年在云南保山香料烟上发现一种由细菌侵染引起的新病害,称为香料烟细菌斑点病。该病主要危害叶片,初为黑褐色水浸状圆形或多角形小斑点,以后病斑扩大、连片,形成不规则的较大坏死斑。从病叶上分离到了28株细菌菌株,菌株接种于香料烟上,发病症状与田间自然症状一致,并从回接病株上重新分离得到此病病原细菌。经过革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、LOPAT试验、生理生化特性分析和16S-23S rDNA序列分析,以及病原菌寄主范围测定,确定该病原菌为丁香假单胞菌烟草致病变种[Pseudomonas syringae pv.tabaci(Wolfet al.)Young et al.]。

3种药剂对猕猴桃花粉溃疡病菌灭菌及果实产量的影响

以陕西周至被溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)污染的猕猴桃花粉为原料,分别用ClO_2溶液、噻霉酮和可杀得三千进行处理,研究3种药剂处理对Psa杀灭率、花粉生活力及处理后的花粉授粉对座果率、产量、单果重和种子数的影响。结果表明,ClO_2溶液、噻霉酮和可杀得三千3种药剂处理对花粉中Psa的杀灭率分别为99.7%,99.6%,99.4%,花粉生活力分别为62.2%,50.1%,51.2%,比对照组分别下降了0.5%,19.1%,24.1%;用处理后的花粉授粉对座果率的影响极显著(P<0.01),ClO_2处理组最佳,比对照组仅降低12%;ClO_2处理组对果实的总产量、单果重和种子数均无显著性差异。说明用10mg/L ClO_2溶液处理花粉45min,对防止猕猴桃花粉传播Psa有较大应用价值。

猕猴桃溃疡病生防芽孢杆菌B2的鉴定及应用

猕猴桃溃疡病是一种毁灭性细菌病害,该病发展迅速,防治难度大,严重制约了猕猴桃产业的发展。为找到一种有效防治该病的方法,针对化学防治易产生抗药性、污染环境、杀伤天敌等特点,从猕猴桃根际土壤中分离共获得25株芽孢杆菌,采用点菌法筛选出4株对猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)具有拮抗效果的菌株(抑菌圈直径达到5 mm以上),其中B2拮抗作用最强。根据菌落(体)形态特征、生理生化鉴定以及16S r DNA序列分析,初步鉴定B2为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。将B2的发酵原液稀释成1×109cfu/m L的发酵液,并在此基础上依次配制50、100、500、1000、2000倍的稀释液,用于盆栽试验。盆栽试验采用喷雾法,30天后的防治效果分别达到了90.45%、86.52%、80.90%、67.98%、47.19%、15.73%,60天后尽管病斑有少量增加,旧病斑有所增大,但与对照相比,病斑增长速度明显减缓。大田试验结果证明,该菌具有较好的生防潜力,喷雾法选择B2发酵液的50倍稀释液,涂抹法选择B2发酵液的100倍稀释液,可有效降低猕猴桃溃疡病的危害。

番茄细菌性斑点病病原鉴定的初步研究

1997～2001年在辽宁省的露地及大棚番茄上分离得到4个菌株,接种番茄幼苗上,发病症状与自然发病症状完全一致,并从接种病株上重新分离到此病原细菌,经革兰氏染色、菌体形态、培养性状、生理生化反应等鉴定,确认该病原菌为丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato（Okabe）Young,Dye＆Wilkie）.

李宝聚博士诊病手记(八十八) 番茄细菌性斑点病症状多样性与综合防治

番茄细菌性斑点病（bacterialspeckoftomato）也称番茄细菌性叶斑病、斑疹病等,是危害全世界番茄生产的重要病害之一,可造成5%～75%的产量损失（Yunisetal.,1980）。1933年该病首次在美国报道（Turgut＆Basim,2013）,之后在南非、印度、澳大利亚、保加利亚、法国、前苏联、巴西、美国、以色列、加拿大等20多个国家发生,并造成严重损失（Basim et al．，2004）。

不同猕猴桃品种对溃疡病菌的抗性评价及其利用

【目的】通过评价当前国内主要猕猴桃品种对溃疡病的抗性表现,为猕猴桃抗病品种的利用提供理论依据。【方法】采用枝条离体划伤接种,分别以红阳和海沃德猕猴桃作为抗感参照品种,对12个猕猴桃品种进行室内抗性鉴定;采用自然诱发接种法对23个猕猴桃品种进行田间抗性鉴定;定点监测不同品种在产业化园区中的抗病性表现。并在此基础上,利用筛选出的抗性品种,在重病园区进行改种,探索利用抗病品种防控猕猴桃溃疡病的实际效果。【结果】不同品种抗病性差异显著,室内抗性鉴定12个供试品种,其中抗病2个、中抗4个、中感6个;田间抗性鉴定23个供试品种,其中高抗3个、抗病2个、中抗6个、中感5个、感病4个、高感3个;规模化生产中红阳、Hort16A和金艳等中华猕猴桃品种表现出高度感病,海沃德、翠玉和魁绿品种表现出较高抗性;将红阳与Hort16A高感品种改换为翠香、翠玉、徐香、海沃德等抗病品种后,植株发病率与病情指数显著降低,相对防效超过85%。【结论】供试品种总体抗性趋势由高到低是软枣、毛花猕猴桃品种>美味猕猴桃品种>中华猕猴桃品种,研究结果表明筛选和利用抗病品种是解决猕猴桃溃疡病危害的有效途径。

番茄细菌性斑点病的发生和防治

1病原和发生症状 番茄细菌性斑点病病原为丁香假单胞菌番茄致病变种。主要危害叶片，也能危害茎、果实和果柄，番茄苗期和成株期均可染病。苗期染病主要发生在叶片上，产生圆形或近圆形暗褐色斑，有黄色晕圈。叶片染病由下部老熟叶片先发病。再向植株上部蔓延，发病初始产生水渍状小圆点斑，

豌豆细菌性疫病菌的分类与检测技术研究进展

由丁香假单胞菌豌豆致病变种引起的豌豆细菌性疫病可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死,导致植株猝倒,对产量影响较大。目前在世界各豌豆重要生产区广泛发生并严重危害,至今尚无有效防治措施。为防范该病菌随着豌豆进口传入我国,需要提高对该病菌的认识,研制更加快速、高效的检测方法。丁香假单胞菌豌豆致病变种与适合致病变种等9个致病变种组成基因型Ⅰ。根据丁香假单胞菌豌豆致病变种与不同豌豆品种致病性的不同,该变种又可分为8个生理小种。利用该病菌特异性片段设计的引物进行PCR扩增产物的不同,可将上述8个生理小种分为2个系统发育群。目前,对该病菌的鉴定主要通过常规的生理生化方法和环介导等温及多位点序列分析等分子生物学方法。上述检测方法存在检测周期长、检测效率低,且不能快速区分阳性结果是否来源于病原菌活细胞或死细胞等问题。可通过探索建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法,来实现快速准确鉴定目标菌种,并对供试菌株的活性进行鉴定的目标。

四川猕猴桃溃疡病的发生与病原研究

实地调查四川5市(县)猕猴桃(Actinidia chinensis)发病情况,从发病果园采集染病枝条并分离病原菌,进行致病性测定,以细菌常规鉴定及基于16S rDNA序列的分子生物学鉴定等确定病原菌。病害调查显示染病猕猴桃枝干上形成渗出白色或红褐色黏液的溃疡;叶片上常形成带黄晕的不规则暗褐色病斑,且名山和苍溪两地的发病情况比起其他三地更为严重。从病枝中分离到5株优势菌株,经鉴定为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudmonas syringae pv.actinidiae)。病害调查中观察到的症状与细菌性溃疡病症状相似,分离得到的病原菌与国内其他地区的报道一致。

贮藏期猕猴桃果实表面溃疡病病原菌的快速检测方法研究

为建立猕猴桃果实表皮溃疡病病原菌(Psa)的快速检测方法,以陕西周至县贮藏期的海沃德猕猴桃为材料,用King’s B液体培养基培养获得果实表面病原菌,采用细菌DNA提取试剂盒及热裂解法提取总DNA;根据陕西猕猴桃Psa的hrp W保守区设计2对特异引物进行巢式PCR扩增,并对扩增产物进行测序。结果表明,从4个猕猴桃贮藏库抽取40个样品,其中8个样品检测出阳性扩增;对特异扩增得到的550bp的hrp W序列进行BLAST对比分析,发现该序列与丁香假单胞杆菌猕猴桃致病性变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的hrp W序列同源性为99%。此外,本试验建立的巢式PCR检测方法对Psa的检出限为103cfu·m L^(-1),检测方法特异性强,灵敏度高,能减少假阳性的出现,保证了快速检测结果的可靠性,为控制猕猴桃果实传播Psa提供了理论依据。

猕猴桃溃疡病及其防治策略

猕猴桃溃疡病为毁灭性细菌性病害,经初步鉴定,病原为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种。菌体短杆状,单细胞,无荚膜,无芽孢。能耐低温、腐生性强。发病以春秋两季为主,春季为烈,低温高湿对其发病有利。该病菌株除侵染猕猴桃外，还能侵染桃、大豆、蚕豆、番茄以及薯、洋葱、魔芋。病菌可随菌脓从病部溢出，远距离靠苗木、接穗传播，近距离靠风、雨、叶蝉、枝剪传播，从植株的气孔、水孔、皮孔、伤口等处侵入。

结果园猕猴桃溃疡病重点防治方法

猕猴桃细菌性溃疡病是猕猴桃上的第一大病害,根据对不同地区的调查与试验,初步确定该病害的药剂防治重点时期和施药方案,供参考。1防控的重点时期猕猴桃溃疡病危害后在发病部位流出菌脓,枝干溃疡、严重时死树(图1~图3),该病由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种引起(图4)。采果后、落叶期、冬剪后至萌芽前、萌芽后至开花前、花后五个时期,是病害防控的重点时期。

番茄叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及Pti互作蛋白筛选

酵母双杂交技术作为检测蛋白质之间相互作用的有效手段,不仅能验证与已知蛋白质的相互作用,还可从文库中筛选与特定蛋白互作的未知蛋白。文章为研究番茄抗病相关蛋白Pti(Pto interaction protein)的生物学功能,筛选与其互作的蛋白,以未处理野生型番茄叶片、真空渗透法接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC 3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)的感病株系prf3、抗性株系PtoR的植株叶片提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.25×107 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度约1200 bp。通过构建Pti5重组诱饵载体并转化酵母菌,筛选与其相互作用的蛋白质。初步获得的Pti5互作的靶标基因,可用于进一步研究番茄抗病基因Pti的作用机制。