丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst DC3000)抗病机制研究进展

丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst DC3000)是导致番茄细菌性叶斑病的主要病原体,严重威胁番茄产量和品质。Pst DC3000是一种局部感染的半生物营养性病原菌,其Ⅲ型分泌系统和冠状毒素生物合成与植物免疫抑制密切相关。Pst DC3000引发的植物免疫反应涉及病原相关分子模式触发免疫和效应器触发免疫两个途径,共同增强植物对病原菌的防御能力,其中水杨酸和茉莉酸信号传导途径在植物免疫防御机制中发挥核心作用。活性氧作为关键信号分子,在植物免疫反应中起“双重作用”,其参与促进植物生长和逆境胁迫下的信号传导,因过量积累导致细胞程序性死亡。文章总结Pst DC3000的抗病机制,为探讨植物激素和活性氧在植物免疫中的作用机制提供新的思路和方法。

丁香精油对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的抑制作用研究

采用水蒸气蒸馏法提取丁香精油,并以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为研究对象,研究了丁香精油的抑菌作用。结果表明,丁香精油对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为7μL·mL^(-1)和14μL·mL^(-1);电导率实验结果表明,随着丁香精油作用时间的延长,菌体膜渗透性发生了改变,特别是金黄色葡萄球菌更为明显;扫描电镜结果表明,丁香精油对菌体细胞形态产生了影响;SDS-PAGE结果表明,丁香精油对菌体蛋白有不同程度的损伤。表明,丁香精油具有较强的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有明显的抑制作用。

丁香假单胞菌在3种苔藓中的致病性研究

【目的】探究细菌性病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)对2种荒漠耐干苔藓以及1种模式苔藓的致病性,为苔藓—病原菌互作模式的构建提供参考,并为抗病基因的筛选提供思路。【方法】选用2种荒漠耐干苔藓——齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)和银叶真藓(Bryum argenteum)以及1种苔藓模式种——小立碗藓(Physcomitrella patens),通过形态学观察和植物抗病指标检测分析丁香假单胞菌在3种苔藓中的致病性以及3种苔藓的响应。【结果】丁香假单胞菌侵染苔藓后,随着接种时间的增加,苔藓细胞死亡量增加,死亡细胞多集中在病害发生区域。过氧化氢(H2O_(2))和超氧阴离子原位染色结果表明:丁香假单胞菌入侵会造成3种苔藓发生免疫反应,且随着接种时间的增加,H2O_(2)和超氧阴离子产生量增多,并以发生病斑及萎蔫植株中的含量最高。荧光定量PCR结果表明:3种苔藓体内的丁香假单胞菌病原菌数量与接种时间呈正相关。【结论】供试的3种苔藓可被丁香假单胞菌成功侵染,表现为出现细菌性病斑、茎秆褐化以及发生褪绿现象。研究结果为后续进一步探讨极端干燥环境下植物—病原菌的互作机制提供了参考。

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,在世界各大猕猴桃产区发病严重。引起该病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)。综合当前国内外关于该病原菌的相关研究,就其分类地位、遗传多样性及起源进化等方面进行了系统综述。

一种利用铁离子螯合剂恢复丁香假单胞菌菌落荧光的方法

丁香假单胞菌产生的荧光色素是一种具有毒性功能的致病性因子,也是细菌鉴定和分类的重要依据。测定了基本培养基不同组分的浓度对丁香假单胞菌荧光色素产生能力的影响,并比较了几种金属离子螯合剂对恢复丁香假单胞菌荧光物质合成能力以及细菌生长能力的影响,旨在找到恢复丁香假单胞菌在常规培养基上合成荧光色素的方法。结果如下:①丁香假单胞菌荧光色素的合成能力主要受培养基中铁离子浓度的影响,而与眎蛋白胨,以及K2HPO4、MgSO4的浓度均无关;②0.05 g/L的螯合剂8-羟基喹啉可使丧失荧光物质合成能力的丁香假单胞菌恢复产生荧光,恢复的荧光物质合成可以被铁盐(FeCl3)逆转;但同时8-羟基喹啉对细菌生长也有一定的抑制作用;③其他金属离子螯合剂,如柠檬酸(C6H8O7.H2O)、酒石酸钠(Na2C4H4O6)、磷酸三钠(Na3PO4)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2),均不能恢复丁香假单胞菌产荧光色素。该结果表明在KB培养基中添加螯合剂8-羟基喹啉(0.05 g/L)可以使丁香假单胞菌恢复荧光物质的合成能力。

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.

应用Logistic模型和王-兰-丁模型分析桑丁香假单胞菌突变株M90-1的冠菌素产量提升因素

采用常压室温等离子体（ARTP）技术诱变处理桑丁香假单胞菌M4-13,应用Logistic模型和王-兰-丁模型分析突变菌株产冠菌素能力提升的因素,为优化诱变高产菌株培养条件等提供依据。突变菌株M90-1的冠菌素产量达84.604 mg/L,较原始菌株M4-13提高了5.755%。应用Logistic模型建立的菌株生长曲线显示突变菌株M90-1的增殖速度明显下降,平均生长速率较原始菌株降低9.933 3%,但菌株的世代历期和对数生长期时长比原始菌株分别延长24.895 9%、27.506 7%,繁殖代数仅提高2.090 4%;用王-兰-丁模型分析环境温度与菌株生长和冠菌素产能的关系,得出突变菌株M90-1的最适生长温度为32.409 5℃,明显高于原始菌株（24.463 0℃）,突变菌株的高温边界层宽度、温度内禀增长力、高温下潜在饱和增长力、高温发育临界温度分别比原始菌株降低89.492 0%、46.841 3%、8.885 3%和2.606 4%;用时间序列差分稳定性分析方法得到突变菌株1～10代的冠菌素产量稳定性好,变幅在2.241 0%之内。研究结果表明：突变菌株M90-1通过延长生长与发育时间提高冠菌素的产能,可以通过优化菌株培养温度促进其生长和提高冠菌素产量。

丁香假单胞菌基因组内简单重复序列的比较分析

【目的】分析丁香假单胞菌3个致病变种基因组内简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),为病菌SSR标记开发和遗传多样性研究提供有用信息。【方法】基于公共的基因组数据库资源,对3个菌株的完全重复SSR和不完全重复SSR的丰度和组成类型等进行分析。【结果】3个菌株完全重复SSR的分布规律较为相似,其中单碱基的短重复SSR均占绝对优势,多碱基和长重复SSR则较少;菌株B728a、1448A和DC3000的不完全重复SSR总数也较相近,分别为562、529和567,其中数量最多的均为六碱基重复。但3个菌株以四、五和六碱基为基序的SSR在基序组成和数量上则表现出较高的变异性,完全重复SSR中,除AGCC、ACCTGC等基序在两个菌株中同时出现,绝大多数基序仅在单个菌株基因组内出现;不完全重复SSR中,部分基序如CCCTG、ACGCA等的出现频率在不同菌株间存在明显差异。【结论】3个菌株的不完全重复SSR在数量和结构类型上均具有较大的相似性,而菌株间的完全重复SSR在数量和组成上则存在一定差异。

丁香假单胞菌的分子生物学研究进展

丁香假单胞菌是好氧、腐生性强的革兰氏阴性菌,所引起的植物病害发生率位居十大细菌性植物病害之首,尤其引发的疫病在各农业大国爆发并有在世界范围扩散的趋势,给各国农业生产造成巨大的经济损失。基于国内外学者最新的分子生物学研究报道,对丁香假单胞菌的致病变种、病原菌鉴定、植物检疫、早期快速检测技术、致病机制及生物防治等方面进行综述,并探讨现阶段该病害研究存在的问题以及未来的研究方向与防治方案。

几种咖啡酸酯类衍生物对桑丁香假单胞菌的抑制活性鉴定

咖啡酸是一类具有多种生物活性的物质,尤其是抑菌活性被应用于农作物病害防治。以天然咖啡酸为先导化合物合成8种咖啡酸酯类衍生物,采用平板扩散法测试咖啡酸及其酯类衍生物对桑疫病病原菌桑丁香假单胞菌Pseudomonas syringae pv.mori的抑菌活性,结果表明:咖啡酸、咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸丙酯和咖啡酸异丙酯对桑丁香假单胞菌、大肠杆菌Escherichia coli(CK)无抑制作用;而咖啡酸丁酯、咖啡酸戊酯、咖啡酸己酯和咖啡酸苯乙酯对桑丁香假单胞菌与大肠杆菌均有抑制作用,其中咖啡酸丁酯、咖啡酸苯乙酯对桑丁香假单胞菌有较强的抑制活性,抑菌圈直径>1.0 cm。进一步通过分光光度法检测初筛有抑菌活性的4种咖啡酸酯类衍生物对桑丁香假单胞菌的MIC_(50)值和MIC_(90)值,抑菌活性由强到弱依次为咖啡酸戊酯、咖啡酸丁酯、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸己酯。试验结果提示,初筛的4种咖啡酸酯类衍生物具有开发为桑疫病防治专用抑菌剂的潜力。

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中６个致病变种全细胞蛋白电泳，发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致，不同致病变种之间存在差异。以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异，结合营养筛选和血清学方法来进行。对丁香假单胞菌的６个致病变种的全细胞蛋白分析表明：全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种。

鉴别丁香假单胞菌丁香致病变种和豌豆致病变种的 DNA 探针的制备

把引起豌豆枯萎病的丁香假单胞菌丁香致病变种 Pseudomonas syringae pv.syringae 菌株3319和丁香假单胞菌豌豆致病变种 P.syringae pv.pisi 的模式菌株2452的染色体 DNA 分别用限制性核酸内切酶 HindⅢ完全消化,再用 T_4DNA 连接酶把消化好的 DNA 片段连接到用HindⅢ内切酶消化的质粒载体 pUC19上,然后把重组的质粒载体转化到大肠杆菌(E.coli RR1)中去克隆.把菌株3319和2452的 DNA 用 p^(32)标记做成探针,分别与克隆菌落杂交,筛选出只对菌株3319的 DNA 有特异性的1个重组 DNA 的克隆和对菌株2452的 DNA 有特异性的2个重组 DNA 克隆.再把这3个重组质粒 DNA 分别用 P^(32)标记做成探针,与菌株3319和2452的 DNA 杂交,也显示只对各自 DNA 来源的菌株具有特异性.这3个重组质粒中,有2个携带有菌株2452的 DNA 片段,1个为0.82 kb。另1个略小于0.58 kb,还有1个质粒携带有菌株3319的 DNA 片段,为0.85 kb.

丁香假单胞菌环式脂肽毒素的生理和分子生物学研究

综合评述了近 10年来在丁香假单胞菌脂肽毒素生理和分子生物学研究上的发现。这些毒素依肽部AA数目可分两组。丁香假单胞霉素组 (syringomycuns)已报告 4个成员 ,肽部有 9个AA ;丁香假单胞肽毒素组有 2个成员 ,肽部分别有 2 2个和 2 5个AA。肽部C 端羧基与分子内羟基氨基酸残基 (AA)的羟基酯化闭合成环 ,再由羟基脂肪酸酰化。两组毒素都诱导植物电解质渗漏、人和动物红血球溶解 ,其机制在于在细胞膜上形成二价阳离子可通过的寡体通道。对酵母菌的抑制作用受固醇的种类影响 ,以胆固醇的保护作用最强。丁香假单胞霉素的合成涉及一个多酶系统 ,有些负责肽合成 ,有些负责运输或调节 ,除受内源调节蛋白调节外 ,也受外源信号分子调节 ,尤其是受植物酚糖苷诱导。这些毒素具有抗真菌活性 ,对人和动物的一些病原霉菌有明显效果 ,在试验剂量无副作用 ,在医药上应用的前景良好。

SPINDLY在壳寡糖诱导拟南芥抗丁香假单胞菌中的功能

为了探讨拟南芥O-岩藻糖基转移酶(SPINDLY)在病原体相关分子模式诱导抗性中的作用,该研究以SPINDLY缺失拟南芥突变体spy-3为实验材料,从叶片表型、病情指数、病菌定殖量以及丁香假单胞菌(Pst DC3000)关键基因的表达水平等指标,系统考察了SPINDLY在壳寡糖诱导拟南芥抗Pst DC3000中的功能。结果显示:(1)spy-3突变体比野生型更易被Pst DC3000侵染。(2)与病菌侵染组相比,壳寡糖预处理明显缓解植株叶片黄化现象,显著降低Pst DC3000的定殖量。(3)壳寡糖预处理的spy-3植株中水杨酸和茉莉酸途径相关基因的表达量及水杨酸和茉莉酸含量均较病菌侵染组明显升高。(4)壳寡糖在spy-3中的诱抗效果与野生型相比无明显差别。研究表明,SPINDLY在植物先天免疫过程发挥重要作用,但并不影响壳寡糖的诱导抗性。

基于实时荧光定量PCR技术检测桑丁香假单胞菌

由桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori,以下简称Psm)引起的桑疫病是一种毁灭性的桑树细菌性病害,建立对病原菌的早期检测技术,有利于及时制定病害的防控技术措施。依据致病性相关基因hrp Z的片段设计的一对引物能够在Psm中特异性地扩增出195 bp大小的条带,而用于对其他致病变种的丁香假单胞菌和其他种属病原菌的扩增则没有此条带。利用Psm14-7菌株基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR(q PCR)扩增,模板DNA质量浓度在6×10^(-5)~6 ng/μL范围内与扩增所得Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-3.224 69x+14.034 45(R^2=0.997 09),检测的最低限为(60±0.001 2)fg/μL;以Psm14-7菌液为模板进行q PCR,菌液浓度在1×10~2~1×10~8CFU/m L范围内与Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-4.562 15x+46.911 67(R^2=0.988 72),最低检测限为(10~2±0.008 3)CFU/m L。于桑树植株人工接种Psm后不同时间,对出现各种症状植株中的菌群数量进行q PCR检测,结果显示:接种后的第4~8天可能为病原菌诱导桑树的过敏性反应和系统获得性抗性关键时期,影响到了Psm的增殖速度;能引起健康桑树暴发桑疫病的致病菌最低浓度为(1.5×10~8±0.076 8)CFU/g。建立的q PCR检测方法,对由Psm引起的桑疫病的田间早期诊断和及时防控具有一定指导意义。

丁香酚对腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌的抑制机理

为探讨丁香酚对海产品冷藏过程中优势腐败菌(腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌)的抑制作用及其机制,本实验先测定丁香酚对腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),然后分别研究了0.5 MIC、1 MIC、2 MIC对腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌生长曲线的影响,通过对比分析丁香酚处理前后细胞的破坏情况,发现细胞外OD260 nm和OD280 nm、钾离子和碱性磷酸酶的水平均上升,细胞内三磷酸腺苷酶活力下降;从丁香酚处理后的扫描电子显微镜图像可看出,完整光滑的菌体出现裂解、粘黏现象,结合傅里叶变换红外光谱所呈现的代表脂质、蛋白质等分子成分官能团的改变,可以得出丁香酚能够破坏细胞壁,并使细胞膜通透性增大、细胞内容物流出,最终导致细胞死亡。

丁香假单胞菌冰核基因inaQ变速箱启动子结构与活性分析

序列比对与结构预测显示丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)野生型菌株MB03的冰核基因inaQ启动子为一种在细菌中罕见的变速箱型启动子。通过克隆长度为522bp的inaQ基因启动子区(P522)并与绿色荧光蛋白基因gfp构建融合基因P522gfp后,在恶臭假单胞菌AB92019菌株中进行表达分析。结果表明,包含结构模块A-Box和B-Box的P522在该菌株中具有启动子活性,且在寡营养条件和较低温度下具有更高的活性,是一种可调控启动子。

1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,简称Psa)是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株(命名为GX05)进行全基因组测序,获得基因组草图,分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现,多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3,与毒力因子数据库比对,GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因,同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对,GX05携带336种耐药基因,与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对,不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多,其中同源性和匹配度最高的是PvdL,此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况,对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

丁香假单胞菌对亚洲玉米螟幼虫抗寒能力的影响

本文用丁香假单胞菌Pseudomonas syringae处理亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)幼虫,使用过冷却仪测定过冷却点,分析该菌株对参试幼虫耐寒能力的影响。结果表明,亚洲玉米螟5龄非滞育幼虫抗寒能力比其他龄期非滞育幼虫强。亚洲玉米螟滞育5龄幼虫抗寒能力比非滞育5龄幼虫强。使用丁香假单胞菌处理亚洲玉米螟5龄非滞育和滞育幼虫,24 h后非滞育幼虫的过冷却点和结冰点分别提高了5.14和2.83℃。5龄滞育幼虫过冷却点和结冰点分别提高了11.25和4.65℃。丁香假单胞菌菌悬液(浓度为8×108 cfu/m L)对亚洲玉米螟具有较好的杀虫效果,非滞育5龄幼虫在(15±1)℃条件下处理24 h后平均死亡率39.1%。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。