三种植物的醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制效果

采用超声波辅助提取的方法,分别用蒸馏水、20%、40%、60%、80%乙醇溶液和无水乙醇溶液对核桃青皮、蕺菜、狭萼鬼吹箫的化学成分进行提取,恒温蒸干获得浸膏后计算各溶剂提取物的得率。利用平板打孔法,分别考察不同浓度乙醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抗菌作用。结果表明,三种植物的不同浓度提取物对该病原菌均具有较好的抑菌效果,抑菌效果依次为:核桃青皮提取物>狭萼鬼吹箫提取物>蕺菜提取物;当用60%乙醇提取核桃青皮、80%乙醇提取蕺菜、40%或60%乙醇提取狭萼鬼吹箫时,分别达到各自的最佳抑菌效果;本试验首次发现狭萼鬼吹箫具有抑菌作用。实验结果显示核桃青皮可作为丁香假单胞菌猕猴桃变种潜在的植源抗菌剂候选材料之一。

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,在世界各大猕猴桃产区发病严重。引起该病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)。综合当前国内外关于该病原菌的相关研究,就其分类地位、遗传多样性及起源进化等方面进行了系统综述。

1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,简称Psa)是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株(命名为GX05)进行全基因组测序,获得基因组草图,分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现,多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3,与毒力因子数据库比对,GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因,同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对,GX05携带336种耐药基因,与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对,不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多,其中同源性和匹配度最高的是PvdL,此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况,对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst DC3000)抗病机制研究进展

丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst DC3000)是导致番茄细菌性叶斑病的主要病原体,严重威胁番茄产量和品质。Pst DC3000是一种局部感染的半生物营养性病原菌,其Ⅲ型分泌系统和冠状毒素生物合成与植物免疫抑制密切相关。Pst DC3000引发的植物免疫反应涉及病原相关分子模式触发免疫和效应器触发免疫两个途径,共同增强植物对病原菌的防御能力,其中水杨酸和茉莉酸信号传导途径在植物免疫防御机制中发挥核心作用。活性氧作为关键信号分子,在植物免疫反应中起“双重作用”,其参与促进植物生长和逆境胁迫下的信号传导,因过量积累导致细胞程序性死亡。文章总结Pst DC3000的抗病机制,为探讨植物激素和活性氧在植物免疫中的作用机制提供新的思路和方法。

四川省丁香假单胞猕猴桃致病变种的遗传多样性分析

为明确四川省猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的遗传多样性及群组划分与地理来源的相关性。以四川省不同地理来源的40个Psa菌株为研究试材,用rep-PCR技术进行分子标记,NTSYS软件分析UPGMA聚类。3对rep-PCR检测引物(REP、ERIC和BOX)共获得42个位点,其中38个为多态位点,占90.5%。UPGMA聚类结果显示,以相似系数为0.70阀值时,40个Psa菌株被分为2个类群(Ⅰ、Ⅱ),其中85.0%的菌株属于第Ⅱ类群;在相似性系数为0.80时,第Ⅰ类又可分为2个亚类(Ⅰ-1、Ⅰ-2),第Ⅱ类则分为5个亚类(Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5),菌株无明显的采集地聚类。以上结果表明,四川省各地区的猕猴桃溃疡病菌菌株具有较高的遗传多样性,但其遗传变异与菌株地理来源无明显相关性。

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中６个致病变种全细胞蛋白电泳，发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致，不同致病变种之间存在差异。以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异，结合营养筛选和血清学方法来进行。对丁香假单胞菌的６个致病变种的全细胞蛋白分析表明：全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种。

鉴别丁香假单胞菌丁香致病变种和豌豆致病变种的 DNA 探针的制备

把引起豌豆枯萎病的丁香假单胞菌丁香致病变种 Pseudomonas syringae pv.syringae 菌株3319和丁香假单胞菌豌豆致病变种 P.syringae pv.pisi 的模式菌株2452的染色体 DNA 分别用限制性核酸内切酶 HindⅢ完全消化,再用 T_4DNA 连接酶把消化好的 DNA 片段连接到用HindⅢ内切酶消化的质粒载体 pUC19上,然后把重组的质粒载体转化到大肠杆菌(E.coli RR1)中去克隆.把菌株3319和2452的 DNA 用 p^(32)标记做成探针,分别与克隆菌落杂交,筛选出只对菌株3319的 DNA 有特异性的1个重组 DNA 的克隆和对菌株2452的 DNA 有特异性的2个重组 DNA 克隆.再把这3个重组质粒 DNA 分别用 P^(32)标记做成探针,与菌株3319和2452的 DNA 杂交,也显示只对各自 DNA 来源的菌株具有特异性.这3个重组质粒中,有2个携带有菌株2452的 DNA 片段,1个为0.82 kb。另1个略小于0.58 kb,还有1个质粒携带有菌株3319的 DNA 片段,为0.85 kb.

双抗体夹心酶联免疫方法检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌

丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌可以引起十字花科细菌性黑斑病,是侵染萝卜、白菜、花椰菜等农作物的重要病害之一。以灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌(NCPPB1820)为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤细胞技术,筛选最终获得6株产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与抗体偶联,作为检测探针,分别将6种单克隆抗体作为包被抗体,进行两两配对筛选。结果表明,所制备的抗体特异性较好,对水稻细菌性谷枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种均没有交叉反应。以6号抗体作为检测抗体(6-HRP),以1号抗体作为包被抗体,建立酶联免疫分析法获得了最佳的敏感度。检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种的最低检测限为1.5×105cfu/m L,定量限为4.12×105cfu/m L。基于双抗体夹心的酶免疫方法特异性好,便捷,可以实现对丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌高通量测定。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究

为研究丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000甘油激酶(Glycerol kinase,GK)的功能,根据Gen Bank中登录的Pst DC3000 GK氨基酸序列设计引物,克隆了Pst DC3000 GK基因,对其生物信息学特征进行分析,然后构建了GK基因敲除突变体,探讨其对菌体生理特性的影响。序列分析表明,GK基因全长1 506 bp,可编码一条501个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,Pst DC3000 GK蛋白分子质量55.8 ku,等电点5.54,富含无规卷曲结构。敲除Pst DC3000 GK后,可降低菌体在基本培养基与丰富培养基中的生长速率,增加细胞中甘油含量,同时也使菌体在拟南芥叶片上的增殖能力降低。因此,Pst DC3000 GK基因参与调控菌体的生长过程,影响菌体甘油代谢。

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。

一种利用铁离子螯合剂恢复丁香假单胞菌菌落荧光的方法

丁香假单胞菌产生的荧光色素是一种具有毒性功能的致病性因子,也是细菌鉴定和分类的重要依据。测定了基本培养基不同组分的浓度对丁香假单胞菌荧光色素产生能力的影响,并比较了几种金属离子螯合剂对恢复丁香假单胞菌荧光物质合成能力以及细菌生长能力的影响,旨在找到恢复丁香假单胞菌在常规培养基上合成荧光色素的方法。结果如下:①丁香假单胞菌荧光色素的合成能力主要受培养基中铁离子浓度的影响,而与眎蛋白胨,以及K2HPO4、MgSO4的浓度均无关;②0.05 g/L的螯合剂8-羟基喹啉可使丧失荧光物质合成能力的丁香假单胞菌恢复产生荧光,恢复的荧光物质合成可以被铁盐(FeCl3)逆转;但同时8-羟基喹啉对细菌生长也有一定的抑制作用;③其他金属离子螯合剂,如柠檬酸(C6H8O7.H2O)、酒石酸钠(Na2C4H4O6)、磷酸三钠(Na3PO4)和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2),均不能恢复丁香假单胞菌产荧光色素。该结果表明在KB培养基中添加螯合剂8-羟基喹啉(0.05 g/L)可以使丁香假单胞菌恢复荧光物质的合成能力。

应用Logistic模型和王-兰-丁模型分析桑丁香假单胞菌突变株M90-1的冠菌素产量提升因素

采用常压室温等离子体（ARTP）技术诱变处理桑丁香假单胞菌M4-13,应用Logistic模型和王-兰-丁模型分析突变菌株产冠菌素能力提升的因素,为优化诱变高产菌株培养条件等提供依据。突变菌株M90-1的冠菌素产量达84.604 mg/L,较原始菌株M4-13提高了5.755%。应用Logistic模型建立的菌株生长曲线显示突变菌株M90-1的增殖速度明显下降,平均生长速率较原始菌株降低9.933 3%,但菌株的世代历期和对数生长期时长比原始菌株分别延长24.895 9%、27.506 7%,繁殖代数仅提高2.090 4%;用王-兰-丁模型分析环境温度与菌株生长和冠菌素产能的关系,得出突变菌株M90-1的最适生长温度为32.409 5℃,明显高于原始菌株（24.463 0℃）,突变菌株的高温边界层宽度、温度内禀增长力、高温下潜在饱和增长力、高温发育临界温度分别比原始菌株降低89.492 0%、46.841 3%、8.885 3%和2.606 4%;用时间序列差分稳定性分析方法得到突变菌株1～10代的冠菌素产量稳定性好,变幅在2.241 0%之内。研究结果表明：突变菌株M90-1通过延长生长与发育时间提高冠菌素的产能,可以通过优化菌株培养温度促进其生长和提高冠菌素产量。

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.

湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分离及其全基因组分析

通过了解湘西地区猕猴桃溃疡病致病菌分类地位和基因类型,初步探讨其致病的分子机理。采用纯培养法分离猕猴桃溃疡病菌;基于16S~23S rRNA基因内转录间隔序列进行病原菌的系统发育分析;通过基因组测序和生物信息学分析解析其致病的分子机理。从“米良1号”和“红阳”猕猴桃感病枝条中分离获得5株溃疡病菌,编号为L211、L212、L321、L322、L323;通过形态特征和16S~23S rRNA基因内转录间隔序列分析,鉴定5株细菌均为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)。以菌株L211为代表进行体外猕猴桃枝条接种实验表明能引起典型溃疡病症状。通过菌株L211的全基因组测序和生物信息学分析,获得5741条基因数目,长5412072 bp;基因功能注释发现菌株L211携带121种毒力因子、71个植物互作因子和77个耐药基因;同时,基因组单核苷酸多态性分析发现病原菌L211为基因Ⅲ型Psa。引起湘西地区猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因Ⅲ型,与国内外报道的引起猕猴桃溃疡病大流行的致病菌一致。猕猴桃溃疡病发病原因可能是病原菌的多种毒力基因和互作基因协同作用的结果。

丁香假单胞菌基因组内简单重复序列的比较分析

【目的】分析丁香假单胞菌3个致病变种基因组内简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),为病菌SSR标记开发和遗传多样性研究提供有用信息。【方法】基于公共的基因组数据库资源,对3个菌株的完全重复SSR和不完全重复SSR的丰度和组成类型等进行分析。【结果】3个菌株完全重复SSR的分布规律较为相似,其中单碱基的短重复SSR均占绝对优势,多碱基和长重复SSR则较少;菌株B728a、1448A和DC3000的不完全重复SSR总数也较相近,分别为562、529和567,其中数量最多的均为六碱基重复。但3个菌株以四、五和六碱基为基序的SSR在基序组成和数量上则表现出较高的变异性,完全重复SSR中,除AGCC、ACCTGC等基序在两个菌株中同时出现,绝大多数基序仅在单个菌株基因组内出现;不完全重复SSR中,部分基序如CCCTG、ACGCA等的出现频率在不同菌株间存在明显差异。【结论】3个菌株的不完全重复SSR在数量和结构类型上均具有较大的相似性,而菌株间的完全重复SSR在数量和组成上则存在一定差异。

丁香假单胞菌的分子生物学研究进展

丁香假单胞菌是好氧、腐生性强的革兰氏阴性菌,所引起的植物病害发生率位居十大细菌性植物病害之首,尤其引发的疫病在各农业大国爆发并有在世界范围扩散的趋势,给各国农业生产造成巨大的经济损失。基于国内外学者最新的分子生物学研究报道,对丁香假单胞菌的致病变种、病原菌鉴定、植物检疫、早期快速检测技术、致病机制及生物防治等方面进行综述,并探讨现阶段该病害研究存在的问题以及未来的研究方向与防治方案。

几种咖啡酸酯类衍生物对桑丁香假单胞菌的抑制活性鉴定

咖啡酸是一类具有多种生物活性的物质,尤其是抑菌活性被应用于农作物病害防治。以天然咖啡酸为先导化合物合成8种咖啡酸酯类衍生物,采用平板扩散法测试咖啡酸及其酯类衍生物对桑疫病病原菌桑丁香假单胞菌Pseudomonas syringae pv.mori的抑菌活性,结果表明:咖啡酸、咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸丙酯和咖啡酸异丙酯对桑丁香假单胞菌、大肠杆菌Escherichia coli(CK)无抑制作用;而咖啡酸丁酯、咖啡酸戊酯、咖啡酸己酯和咖啡酸苯乙酯对桑丁香假单胞菌与大肠杆菌均有抑制作用,其中咖啡酸丁酯、咖啡酸苯乙酯对桑丁香假单胞菌有较强的抑制活性,抑菌圈直径>1.0 cm。进一步通过分光光度法检测初筛有抑菌活性的4种咖啡酸酯类衍生物对桑丁香假单胞菌的MIC_(50)值和MIC_(90)值,抑菌活性由强到弱依次为咖啡酸戊酯、咖啡酸丁酯、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸己酯。试验结果提示,初筛的4种咖啡酸酯类衍生物具有开发为桑疫病防治专用抑菌剂的潜力。

丁香精油对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的抑制作用研究

采用水蒸气蒸馏法提取丁香精油,并以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为研究对象,研究了丁香精油的抑菌作用。结果表明,丁香精油对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为7μL·mL^(-1)和14μL·mL^(-1);电导率实验结果表明,随着丁香精油作用时间的延长,菌体膜渗透性发生了改变,特别是金黄色葡萄球菌更为明显;扫描电镜结果表明,丁香精油对菌体细胞形态产生了影响;SDS-PAGE结果表明,丁香精油对菌体蛋白有不同程度的损伤。表明,丁香精油具有较强的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有明显的抑制作用。

猕猴桃溃疡病病原菌MLVA分型引物的筛选及验证

【目的】筛选出一组可精准快速地对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)进行分型的引物组合。【方法】针对前期文献已报道的34对引物,采用PCR技术验证该34对引物对中国Psa菌株的扩增效率及准确性;利用模拟PCR获取菌株串联重复(TR)数;以辛普森指数(Simpson’s index,SI)作为筛选引物组合的标准,基于R软件平台,筛选最优引物组合。【结果】34对引物对中国Psa扩增效果均良好,其中TR14与TR11II、TR19与Psa-01引物序列相同;TR8与Psa-08、TR39II与Psa-10、GM-1834与TR10I、GM-1553与TR64II、TR19Psa-01与TR19II扩增同一TR;Psa-09扩增产物串联重复单元长度不唯一,TR2II扩增产物侧翼变异较大,不能通过电泳确定串联重复数;最终确定SI值与全部引物组合相同的最低引物数量为9对,使用该9对引物的组合可将Psa已知的5种生物型准确分开。【结论】TR23/Psa-04、Psa-03、Psa-05、Psa-06、TR10IGM-1834、TR30I、TR1II、Psa-10TR39II、TR64IIGM-1553等9对引物可代表当前文献报道的34对引物,进行Psa分型研究,探索猕猴桃溃疡病的传播和流行规律,为病害防控策略的制定提供科学依据。