丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,在世界各大猕猴桃产区发病严重。引起该病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)。综合当前国内外关于该病原菌的相关研究,就其分类地位、遗传多样性及起源进化等方面进行了系统综述。

1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,简称Psa)是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株(命名为GX05)进行全基因组测序,获得基因组草图,分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现,多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3,与毒力因子数据库比对,GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因,同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对,GX05携带336种耐药基因,与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对,不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多,其中同源性和匹配度最高的是PvdL,此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况,对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

四川省丁香假单胞猕猴桃致病变种的遗传多样性分析

为明确四川省猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的遗传多样性及群组划分与地理来源的相关性。以四川省不同地理来源的40个Psa菌株为研究试材,用rep-PCR技术进行分子标记,NTSYS软件分析UPGMA聚类。3对rep-PCR检测引物(REP、ERIC和BOX)共获得42个位点,其中38个为多态位点,占90.5%。UPGMA聚类结果显示,以相似系数为0.70阀值时,40个Psa菌株被分为2个类群(Ⅰ、Ⅱ),其中85.0%的菌株属于第Ⅱ类群;在相似性系数为0.80时,第Ⅰ类又可分为2个亚类(Ⅰ-1、Ⅰ-2),第Ⅱ类则分为5个亚类(Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5),菌株无明显的采集地聚类。以上结果表明,四川省各地区的猕猴桃溃疡病菌菌株具有较高的遗传多样性,但其遗传变异与菌株地理来源无明显相关性。

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中６个致病变种全细胞蛋白电泳，发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致，不同致病变种之间存在差异。以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异，结合营养筛选和血清学方法来进行。对丁香假单胞菌的６个致病变种的全细胞蛋白分析表明：全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种。

三种植物的醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制效果

采用超声波辅助提取的方法,分别用蒸馏水、20%、40%、60%、80%乙醇溶液和无水乙醇溶液对核桃青皮、蕺菜、狭萼鬼吹箫的化学成分进行提取,恒温蒸干获得浸膏后计算各溶剂提取物的得率。利用平板打孔法,分别考察不同浓度乙醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抗菌作用。结果表明,三种植物的不同浓度提取物对该病原菌均具有较好的抑菌效果,抑菌效果依次为:核桃青皮提取物>狭萼鬼吹箫提取物>蕺菜提取物;当用60%乙醇提取核桃青皮、80%乙醇提取蕺菜、40%或60%乙醇提取狭萼鬼吹箫时,分别达到各自的最佳抑菌效果;本试验首次发现狭萼鬼吹箫具有抑菌作用。实验结果显示核桃青皮可作为丁香假单胞菌猕猴桃变种潜在的植源抗菌剂候选材料之一。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究

为研究丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000甘油激酶(Glycerol kinase,GK)的功能,根据Gen Bank中登录的Pst DC3000 GK氨基酸序列设计引物,克隆了Pst DC3000 GK基因,对其生物信息学特征进行分析,然后构建了GK基因敲除突变体,探讨其对菌体生理特性的影响。序列分析表明,GK基因全长1 506 bp,可编码一条501个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,Pst DC3000 GK蛋白分子质量55.8 ku,等电点5.54,富含无规卷曲结构。敲除Pst DC3000 GK后,可降低菌体在基本培养基与丰富培养基中的生长速率,增加细胞中甘油含量,同时也使菌体在拟南芥叶片上的增殖能力降低。因此,Pst DC3000 GK基因参与调控菌体的生长过程,影响菌体甘油代谢。

猕猴桃细菌性溃疡病菌的分离鉴定与致病性分析

溃疡病是猕猴桃主要细菌性病害,其病原为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)。文章利用不同猕猴桃种植园的溃疡病发病植株进行Psa菌株分离、鉴定及致病性分析;结果显示,获得了6个具有丁香假单胞菌形态特征的菌株,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定与序列同源比对,所分离菌株为Psa,该菌株在‘红阳’猕猴桃的接种检测中显示不同致病性,其中ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1接种植株出现溃疡病症状,而ScMbJ1、ScDjyH3、ScYaH2未表现显著致病性。烟草叶片超敏反应也显示它们具有不同的植物免疫系统激活能力。该研究获得了猕猴桃溃疡病分离菌株,其表型差异为后续的致病基因遗传分析奠定了基础。

湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分离及其全基因组分析

通过了解湘西地区猕猴桃溃疡病致病菌分类地位和基因类型,初步探讨其致病的分子机理。采用纯培养法分离猕猴桃溃疡病菌;基于16S~23S rRNA基因内转录间隔序列进行病原菌的系统发育分析;通过基因组测序和生物信息学分析解析其致病的分子机理。从“米良1号”和“红阳”猕猴桃感病枝条中分离获得5株溃疡病菌,编号为L211、L212、L321、L322、L323;通过形态特征和16S~23S rRNA基因内转录间隔序列分析,鉴定5株细菌均为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)。以菌株L211为代表进行体外猕猴桃枝条接种实验表明能引起典型溃疡病症状。通过菌株L211的全基因组测序和生物信息学分析,获得5741条基因数目,长5412072 bp;基因功能注释发现菌株L211携带121种毒力因子、71个植物互作因子和77个耐药基因;同时,基因组单核苷酸多态性分析发现病原菌L211为基因Ⅲ型Psa。引起湘西地区猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因Ⅲ型,与国内外报道的引起猕猴桃溃疡病大流行的致病菌一致。猕猴桃溃疡病发病原因可能是病原菌的多种毒力基因和互作基因协同作用的结果。

猕猴桃溃疡病病原菌MLVA分型引物的筛选及验证

【目的】筛选出一组可精准快速地对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)进行分型的引物组合。【方法】针对前期文献已报道的34对引物,采用PCR技术验证该34对引物对中国Psa菌株的扩增效率及准确性;利用模拟PCR获取菌株串联重复(TR)数;以辛普森指数(Simpson’s index,SI)作为筛选引物组合的标准,基于R软件平台,筛选最优引物组合。【结果】34对引物对中国Psa扩增效果均良好,其中TR14与TR11II、TR19与Psa-01引物序列相同;TR8与Psa-08、TR39II与Psa-10、GM-1834与TR10I、GM-1553与TR64II、TR19Psa-01与TR19II扩增同一TR;Psa-09扩增产物串联重复单元长度不唯一,TR2II扩增产物侧翼变异较大,不能通过电泳确定串联重复数;最终确定SI值与全部引物组合相同的最低引物数量为9对,使用该9对引物的组合可将Psa已知的5种生物型准确分开。【结论】TR23/Psa-04、Psa-03、Psa-05、Psa-06、TR10IGM-1834、TR30I、TR1II、Psa-10TR39II、TR64IIGM-1553等9对引物可代表当前文献报道的34对引物,进行Psa分型研究,探索猕猴桃溃疡病的传播和流行规律,为病害防控策略的制定提供科学依据。

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

【目的】由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害。病原细菌主要通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)将多种效应蛋白(T3SS effector,T3SE)注入寄主植物细胞,进而促进病菌侵染和致病。本研究旨在解析Psa基因组中T3SE的信息并对其T3SS和T3SE的致病功能进行系统分析,为溃疡病菌致病机制的研究和防治策略的制定提供依据。【方法】利用marker-free同源重组基因敲除技术获得M228菌株的T3SS功能缺陷突变体ΔhrcS和ΔhrcC,观察突变体在寄主上的致病力,同时检测突变体诱导本氏烟产生细胞坏死的情况;随后利用从Pseudomonas-Plant Interaction数据库下载的T3SE数据库,本地BLAST多序列比对构建强、弱致病菌株M228和M227的T3SE库,并对二者的T3SE基因信息进行比对分析;另外,获得M228菌株T3SE单、多效应子突变菌株20株及2株HopR1基因回补菌株(共涉及19个T3SE),并将各突变体室内有伤接菌猕猴桃枝条,系统评价各突变体致病力变化并进行统计分析。【结果】通过对Psa的hrcS和hrcC基因进行突变,证明T3SS是其在寄主上致病以及非寄主上过敏性坏死反应(HR)所必需的。通过数据库同源比对,发现在强毒株系和弱毒株系中有31个T3SE基因具有100%的同源性,选取一些基因进行缺失突变,发现hopM1/avrE1和hopR1是Psa重要的毒性因子,且二者不存在功能冗余。另外,单独敲除avrPto5或avrRpm1均能提高Psa致病力。在缺失A-F-E基因簇和avrPto5的菌株中,敲除hopM1/avrE1和hopR1也分别导致Psa的致病力显著下降;而同时敲除hopM1/avrE1、hopR1、avrPto5和A-F-E基因簇导致病菌完全丧失致病力。【结论】HopM1/AvrE1与同家族HopR1均为Psa重要致病因子,且独立于其他效应子发挥作用;avrPto5和avrRpm1基因缺失可以增强Psa的致病力。

低温等离子活化水对猕猴桃溃疡病菌抗菌活性及机制

为了探究低温等离子体活化水(cold plasma activated water,PAW)对丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,PSA)的抗菌活性和潜在机制。该研究通过介质阻挡放电(dielectric barrier discharge,DBD)低温等离子体发生装置制备不同激活时间的PAW,考察放电时间与杀菌效果之间的关系。此外,通过评估PSA形态特征,细胞粒径、DNA、细胞膜损伤情况和胞内活性氧积累(reactive oxygen species,ROS)情况探究PAW对PSA的杀菌机制。结果表明:PAW对PSA的杀灭效果与PAW激活时间呈依赖性,与对照相比PAW处理120 s后,PSA显著(P<0.05)减少了4.38 lg CFU/mL。扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)结果清楚地表明,由于PAW处理,PSA细胞发生了明显的质壁分离。荧光染色结果显示,PSA细胞DNA、膜渗透屏障被破坏程度、内容物泄漏量和ROS积累量与PAW激活时间表现为正相关关系。因此,推测PAW由于自身酸性、较高的氧化还原电位(oxidation-reduction potential,ORP),以及水性活性物质导致细胞的氧化损伤,而且这可能是杀灭PSA的主要原因。研究结果可为PAW控制猕猴桃细菌性溃疡病提供参考。

猕猴桃溃疡病菌在中国的适生性分析

通过分析猕猴桃溃疡病菌在中国的适生性,为科学制定有效的检疫监管措施,防范其入侵和扩散,确保猕猴桃产业健康发展提供理论依据。本研究根据前人研究结果,采用模糊数学综合评判的原理和方法,定量分析猕猴桃细菌性溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)在我国各个地区的适生性。猕猴桃溃疡病菌在我国最适宜的省份主要分布在四川、云南、贵州、福建、安徽、湖南、湖北、河南、江西、陕西、浙江、重庆、西藏。鉴于该病具有发生发展迅速,危害性强,防治难度大等特点,应当加强猕猴桃种苗等繁殖材料的检疫,加强对果园的管理和病害监测,积极采取有效的防治措施并加强抗病育种方面的研究。

ClO_2对猕猴桃表面溃疡病病菌的杀菌作用及果实货架期品质的影响

为杀灭猕猴桃果实表面溃疡病病原菌并保持果实货架期品质,以丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(Psa)和海沃德猕猴桃果实为试验材料,通过单因素和响应曲面分析法研究二氧化氯(ClO_2)对Psa的杀灭效果及对猕猴桃果实货架期品质的影响。结果表明,最佳杀菌工艺条件为ClO_2溶液浓度115 mg·L^(-1)、处理时间8 min、pH值4,在此最佳工艺条件下,ClO_2溶液对Psa的杀菌率的最大预期值可达100%,对猕猴桃果实表面的Psa杀菌率为98.64%,并能延缓猕猴桃果实硬度的下降,保持可溶性固形物、Vc、可滴定酸的含量,延长果实的货架期。综上可知,ClO_2溶液处理既能杀灭猕猴桃表面Psa,又能保持果实货架期品质。本研究结果为控制猕猴桃果实传播Psa及其保鲜提供了理论依据。

猕猴桃溃疡病生防芽孢杆菌B2的鉴定及应用

猕猴桃溃疡病是一种毁灭性细菌病害,该病发展迅速,防治难度大,严重制约了猕猴桃产业的发展。为找到一种有效防治该病的方法,针对化学防治易产生抗药性、污染环境、杀伤天敌等特点,从猕猴桃根际土壤中分离共获得25株芽孢杆菌,采用点菌法筛选出4株对猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)具有拮抗效果的菌株(抑菌圈直径达到5 mm以上),其中B2拮抗作用最强。根据菌落(体)形态特征、生理生化鉴定以及16S r DNA序列分析,初步鉴定B2为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。将B2的发酵原液稀释成1×109cfu/m L的发酵液,并在此基础上依次配制50、100、500、1000、2000倍的稀释液,用于盆栽试验。盆栽试验采用喷雾法,30天后的防治效果分别达到了90.45%、86.52%、80.90%、67.98%、47.19%、15.73%,60天后尽管病斑有少量增加,旧病斑有所增大,但与对照相比,病斑增长速度明显减缓。大田试验结果证明,该菌具有较好的生防潜力,喷雾法选择B2发酵液的50倍稀释液,涂抹法选择B2发酵液的100倍稀释液,可有效降低猕猴桃溃疡病的危害。

贮藏期猕猴桃果实表面溃疡病病原菌的快速检测方法研究

为建立猕猴桃果实表皮溃疡病病原菌(Psa)的快速检测方法,以陕西周至县贮藏期的海沃德猕猴桃为材料,用King’s B液体培养基培养获得果实表面病原菌,采用细菌DNA提取试剂盒及热裂解法提取总DNA;根据陕西猕猴桃Psa的hrp W保守区设计2对特异引物进行巢式PCR扩增,并对扩增产物进行测序。结果表明,从4个猕猴桃贮藏库抽取40个样品,其中8个样品检测出阳性扩增;对特异扩增得到的550bp的hrp W序列进行BLAST对比分析,发现该序列与丁香假单胞杆菌猕猴桃致病性变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)的hrp W序列同源性为99%。此外,本试验建立的巢式PCR检测方法对Psa的检出限为103cfu·m L^(-1),检测方法特异性强,灵敏度高,能减少假阳性的出现,保证了快速检测结果的可靠性,为控制猕猴桃果实传播Psa提供了理论依据。

3种药剂对猕猴桃花粉溃疡病菌灭菌及果实产量的影响

以陕西周至被溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)污染的猕猴桃花粉为原料,分别用ClO_2溶液、噻霉酮和可杀得三千进行处理,研究3种药剂处理对Psa杀灭率、花粉生活力及处理后的花粉授粉对座果率、产量、单果重和种子数的影响。结果表明,ClO_2溶液、噻霉酮和可杀得三千3种药剂处理对花粉中Psa的杀灭率分别为99.7%,99.6%,99.4%,花粉生活力分别为62.2%,50.1%,51.2%,比对照组分别下降了0.5%,19.1%,24.1%;用处理后的花粉授粉对座果率的影响极显著(P<0.01),ClO_2处理组最佳,比对照组仅降低12%;ClO_2处理组对果实的总产量、单果重和种子数均无显著性差异。说明用10mg/L ClO_2溶液处理花粉45min,对防止猕猴桃花粉传播Psa有较大应用价值。

猕猴桃溃疡病菌噬菌体的初步研究

以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为指示菌,从猕猴桃溃疡病病枝中分离到一株噬菌体,对该噬菌体进行了热稳定性、pH值稳定性、紫外线稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的测定。结果表明：噬菌体的热稳定性较弱,在65℃下10 min内即可全部失活;在pH值4-9的范围内噬菌体均可稳定存在;紫外线下照射12 min,噬菌体几乎全部失活;噬菌体的最佳感染复数为0.1;感染指示菌的潜伏期约60 min,爆发期约70 min,烈解量为123。这是首次关于猕猴桃溃疡病菌噬菌体的报道。

猕猴桃溃疡病病原菌及检测方法研究进展

猕猴桃细菌性溃疡病的发生具有潜伏性、传播速度快、防治困难等特点,目前已经成为一种危害世界猕猴桃生产的毁灭性病害,其病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidi-ae,Psa)。综合国内外相关研究报道,就猕猴桃溃疡病病原菌特点、防治、传播及检测等方面进行了系统综述,旨在加深对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的认识,同时为开展该病原菌的早期检测及防治研究奠定基础。

陕西省猕猴桃溃疡病病原菌分离鉴定及分型研究

明确陕西省猕猴桃主产区丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的变型,从而有针对性地制定猕猴桃溃疡病的综合防治策略,采集陕西省猕猴桃主产区周至、眉县、灞桥、渭南、长安和鄠邑不同年份发病样本进行病原菌的分离,对病原菌进行初步鉴定后再应用特异性PCR进行分子鉴定,并进行回接实验。从鉴定出的Psa菌株中选出16株不同年份不同地区的代表性菌株应用7个管家基因进行MLSA分型分析。共分离鉴定出86株不同地区不同年份的Psa菌株,并通过回接实验验证了其致病性。MLSA分型结果表明16株代表性Psa菌株均属于Psa3,且Psa3与Psa6的遗传距离最近。陕西省猕猴主产区的Psa变型为Psa3,近十年未发生变异。研究结果为今后Psa的检测鉴定及防治研究提供参考。