丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究

为研究丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000甘油激酶(Glycerol kinase,GK)的功能,根据Gen Bank中登录的Pst DC3000 GK氨基酸序列设计引物,克隆了Pst DC3000 GK基因,对其生物信息学特征进行分析,然后构建了GK基因敲除突变体,探讨其对菌体生理特性的影响。序列分析表明,GK基因全长1 506 bp,可编码一条501个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,Pst DC3000 GK蛋白分子质量55.8 ku,等电点5.54,富含无规卷曲结构。敲除Pst DC3000 GK后,可降低菌体在基本培养基与丰富培养基中的生长速率,增加细胞中甘油含量,同时也使菌体在拟南芥叶片上的增殖能力降低。因此,Pst DC3000 GK基因参与调控菌体的生长过程,影响菌体甘油代谢。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

拟南芥果胶甲酯化酶基因PME17在抵御丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株中的功能

细胞壁是植物抵御病原菌入侵的第一道屏障,果胶是细胞壁初生壁的主要组分。果胶甲酯化酶(PME)是修饰果胶的主要酶之一,它在合成细胞壁、调节其弹性和通透性等过程中发挥重要作用。拟南芥基因表达数据库显示,PME17等多个果胶甲酯化酶基因在病原菌侵染情况下强烈表达。本文研究了PME17的组织表达及其在丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株(Pst DC3000)侵染过程中的功能。结果表明,在未受Pst DC3000侵染的条件下,PME17基因在主根、根毛、子叶、叶毛、花粉等部位表达;在受Pst DC3000感染时,PME17表达显著增强。和野生型相比,pme17突变体对Pst DC3000侵染更加敏感,说明拟南芥PME17基因的表达受Pst DC3000的诱导,并在防御Pst DC3000侵染中起积极作用。

番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

1998～ 1999年在吉林省、辽宁省、黑龙江省等地的大棚番茄上发现一种番茄病害 ,并从其病叶、病茎杆上分离得到了 2 3个细菌菌株。接种番茄幼苗上 ,发病症状与自然发病症状完全一致 ,并从接种病株上重新分离到此病原细菌。各菌株致病力无明显的差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、G+ C mol%等鉴定 ,确认该病原菌为丁香假单胞杆菌番茄致病变种 (Pseu-domonas syringae pv.tomato(Okabe) Young,Dye & Wilkie)。该病菌引起番茄细菌性斑点病 (又称叶斑病 )。病菌除侵染番茄外 ,尚能侵染茄子、辣椒、龙葵、白花曼陀罗和毛曼陀罗。该病害尚属我国大陆首次报道。

李宝聚博士诊病手记(八十八) 番茄细菌性斑点病症状多样性与综合防治

番茄细菌性斑点病（bacterialspeckoftomato）也称番茄细菌性叶斑病、斑疹病等,是危害全世界番茄生产的重要病害之一,可造成5%～75%的产量损失（Yunisetal.,1980）。1933年该病首次在美国报道（Turgut＆Basim,2013）,之后在南非、印度、澳大利亚、保加利亚、法国、前苏联、巴西、美国、以色列、加拿大等20多个国家发生,并造成严重损失（Basim et al．，2004）。

亚高温环境下番茄对细菌性斑点病病原菌的抗性变化及其机制研究

在全球气候变暖的大背景下,园艺作物在设施及露地生产中病虫害高发频发,严重威胁园艺产品的产量、品质和安全,而亚高温环境如何影响园艺作物的抗病性尚不清楚。细菌性斑点病是由丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato,Pst)引起的在我国番茄生产中广泛发生的重要病害。本试验以含抗Pst基因Pto的高抗番茄LA3472及其背景基因型高感番茄Moneymaker为试验材料,探究亚高温环境下番茄的模式触发的免疫(PAMPs-triggered immunity,PTI)和效应蛋白触发的免疫(effector-triggered immunity,ETI)两种不同抗病途径对Pst DC3000的响应变化。结果表明:与24 ℃常温相比,30 ℃亚高温对体外培养的Pst DC3000菌株的增殖速度无明显影响,但Moneymaker和LA3472在接种Pst DC3000后,细菌性斑点病害的发生均显著加重。亚高温下,2份番茄材料的水杨酸(SA)积累量在接种病原菌后均比常温下接种显著减少,受Pst DC3000诱导的水杨酸合成基因PALs和信号转导基因NPR1的转录表达也被显著抑制。由此可见,亚高温对番茄对细菌性斑点病的不同抗性途径PTI和ETI均有抑制作用,推测其和SA抗性路径被抑制有关。本试验对于理解温度升高背景下蔬菜作物病害发生及加强病害防控具有理论和现实意义。

番茄细菌性斑点病的发生和防治

1病原和发生症状 番茄细菌性斑点病病原为丁香假单胞菌番茄致病变种。主要危害叶片，也能危害茎、果实和果柄，番茄苗期和成株期均可染病。苗期染病主要发生在叶片上，产生圆形或近圆形暗褐色斑，有黄色晕圈。叶片染病由下部老熟叶片先发病。再向植株上部蔓延，发病初始产生水渍状小圆点斑，

番茄叶片酵母双杂交cDNA文库的构建及Pti互作蛋白筛选

酵母双杂交技术作为检测蛋白质之间相互作用的有效手段,不仅能验证与已知蛋白质的相互作用,还可从文库中筛选与特定蛋白互作的未知蛋白。文章为研究番茄抗病相关蛋白Pti(Pto interaction protein)的生物学功能,筛选与其互作的蛋白,以未处理野生型番茄叶片、真空渗透法接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC 3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)的感病株系prf3、抗性株系PtoR的植株叶片提取RNA,构建酵母双杂交文库。经检测,文库容量为1.25×107 CFU,阳性率大于95%,插入片段平均长度约1200 bp。通过构建Pti5重组诱饵载体并转化酵母菌,筛选与其相互作用的蛋白质。初步获得的Pti5互作的靶标基因,可用于进一步研究番茄抗病基因Pti的作用机制。

病原菌Pst DC3000侵染拟南芥导致自噬和光合作用的抑制

在病原菌侵染下,植物体是如何通过超敏反应限制病原菌扩增的,到目前为止还不清楚。最近的研究显示自噬起了必要的作用,可见,研究自噬和超敏反应的机制非常重要。本研究通过观察在非寄主病原菌突变体丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomatoDC3000,Pst DC3000)的侵染下,拟南芥光合功能的变化及自噬现象出现的情况,以为进一步研究植物抗病机理提供实验基础。以野生型拟南芥为材料,采用光谱分析和叶绿素荧光成像分析手段,研究不同浓度的Pst DC3000侵染对拟南芥离体叶片光合功能的影响;以转基因野生型拟南芥(绿色荧光蛋白标记的自噬基因8a)幼根为材料,应用共聚焦显微镜,研究不同浓度的Pst DC3000诱导拟南芥自噬的情况。实验发现,OD600=0.2的Pst DC3000侵染,可显著诱导拟南芥叶片活性氧的积累和迸发,并会引起拟南芥叶片光合作用效率的下降。同时发现,该病原菌处理2 h,可导致拟南芥根中自噬小体的产生。用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)标记活性氧,检测了Pst DC3000作用下叶片活性氧产生量的变化,发现,在OD600=0.2的Pst DC3000作用下,90 min内,叶片组织中的活性氧产生了明显的积累。以上结果说明:Pst DC3000侵染叶片,导致了活性氧迸发和光合系统的受损,进而推测这两个结果具有相关性;在植物与病原菌的互作系统中,光合系统的变化规律可以作为典型的指标来加以检测。

番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g^(-1);检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g^(-1)。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。