丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,在世界各大猕猴桃产区发病严重。引起该病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)。综合当前国内外关于该病原菌的相关研究,就其分类地位、遗传多样性及起源进化等方面进行了系统综述。

丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中６个致病变种全细胞蛋白电泳，发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致，不同致病变种之间存在差异。以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异，结合营养筛选和血清学方法来进行。对丁香假单胞菌的６个致病变种的全细胞蛋白分析表明：全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种。

双抗体夹心酶联免疫方法检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌

丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌可以引起十字花科细菌性黑斑病,是侵染萝卜、白菜、花椰菜等农作物的重要病害之一。以灭活的丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌(NCPPB1820)为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤细胞技术,筛选最终获得6株产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)与抗体偶联,作为检测探针,分别将6种单克隆抗体作为包被抗体,进行两两配对筛选。结果表明,所制备的抗体特异性较好,对水稻细菌性谷枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种均没有交叉反应。以6号抗体作为检测抗体(6-HRP),以1号抗体作为包被抗体,建立酶联免疫分析法获得了最佳的敏感度。检测丁香假单胞杆菌斑点致病变种的最低检测限为1.5×105cfu/m L,定量限为4.12×105cfu/m L。基于双抗体夹心的酶免疫方法特异性好,便捷,可以实现对丁香假单胞杆菌斑点致病变种病菌高通量测定。

1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,简称Psa)是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株(命名为GX05)进行全基因组测序,获得基因组草图,分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现,多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3,与毒力因子数据库比对,GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因,同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对,GX05携带336种耐药基因,与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对,不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多,其中同源性和匹配度最高的是PvdL,此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况,对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究

为研究丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000甘油激酶(Glycerol kinase,GK)的功能,根据Gen Bank中登录的Pst DC3000 GK氨基酸序列设计引物,克隆了Pst DC3000 GK基因,对其生物信息学特征进行分析,然后构建了GK基因敲除突变体,探讨其对菌体生理特性的影响。序列分析表明,GK基因全长1 506 bp,可编码一条501个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,Pst DC3000 GK蛋白分子质量55.8 ku,等电点5.54,富含无规卷曲结构。敲除Pst DC3000 GK后,可降低菌体在基本培养基与丰富培养基中的生长速率,增加细胞中甘油含量,同时也使菌体在拟南芥叶片上的增殖能力降低。因此,Pst DC3000 GK基因参与调控菌体的生长过程,影响菌体甘油代谢。

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。

丁香假单胞大豆致病变种不同HrpZ蛋白差异区域功能研究

[目的]丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株编码产生的Hrp Z蛋白差异序列主要集中在C端的3个区域,并且这2个蛋白诱导非寄主HR的能力也存在差异。本研究将探究Hrp Z蛋白这3个差异区域在烟草上诱导HR(hypersensitive response)和抑制烟草花叶病毒(TMV)中所起的作用。[方法]采用常规PCR及重叠PCR方法将这2个hrp Z基因的3个差异区域分别进行互换,构建了相应的重组表达载体,表达并纯化得到了6个重组蛋白,相对分子质量均在41×103左右。并检测了其诱导HR活性、诱导植物抗病性。[结果]检测结果表明:重组蛋白Hrp ZS(S2→A2)和Hrp ZA(A3→S3)诱导HR的能力相比亲本都有所增强,6个重组蛋白诱导烟草抗TMV的活性都明显强于亲本,其中,Hrp ZA(A3→S3)和Hrp ZS(S3→A3)的活性最强。[结论]此试验表明Hrp Z蛋白的这些差异区域(第7、8、9个α-螺旋)是过敏反应能力的主要调控区域,同时C-端第8、9个α-螺旋区域与诱导植物抗病性也显著相关。本研究为改造Hrp Z类harpin蛋白激发子,提高其诱导抗性及功能域研究提供了理论依据。

四川省丁香假单胞猕猴桃致病变种的遗传多样性分析

为明确四川省猕猴桃溃疡病菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的遗传多样性及群组划分与地理来源的相关性。以四川省不同地理来源的40个Psa菌株为研究试材,用rep-PCR技术进行分子标记,NTSYS软件分析UPGMA聚类。3对rep-PCR检测引物(REP、ERIC和BOX)共获得42个位点,其中38个为多态位点,占90.5%。UPGMA聚类结果显示,以相似系数为0.70阀值时,40个Psa菌株被分为2个类群(Ⅰ、Ⅱ),其中85.0%的菌株属于第Ⅱ类群;在相似性系数为0.80时,第Ⅰ类又可分为2个亚类(Ⅰ-1、Ⅰ-2),第Ⅱ类则分为5个亚类(Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5),菌株无明显的采集地聚类。以上结果表明,四川省各地区的猕猴桃溃疡病菌菌株具有较高的遗传多样性,但其遗传变异与菌株地理来源无明显相关性。

三种植物的醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抑制效果

采用超声波辅助提取的方法,分别用蒸馏水、20%、40%、60%、80%乙醇溶液和无水乙醇溶液对核桃青皮、蕺菜、狭萼鬼吹箫的化学成分进行提取,恒温蒸干获得浸膏后计算各溶剂提取物的得率。利用平板打孔法,分别考察不同浓度乙醇提取物对丁香假单胞菌猕猴桃变种的抗菌作用。结果表明,三种植物的不同浓度提取物对该病原菌均具有较好的抑菌效果,抑菌效果依次为:核桃青皮提取物>狭萼鬼吹箫提取物>蕺菜提取物;当用60%乙醇提取核桃青皮、80%乙醇提取蕺菜、40%或60%乙醇提取狭萼鬼吹箫时,分别达到各自的最佳抑菌效果;本试验首次发现狭萼鬼吹箫具有抑菌作用。实验结果显示核桃青皮可作为丁香假单胞菌猕猴桃变种潜在的植源抗菌剂候选材料之一。

黄瓜细菌性茎枯萎病病原鉴定及温度对其致病力的影响

自2003年以来,在我国北京、辽宁和山东等地的黄瓜上发现了一种重要细菌病害—黄瓜细菌性茎枯萎病,对黄瓜生产造成了严重危害。从发病的黄瓜叶片、茎部和果实上分离的菌株接种到黄瓜后,症状与自然发病症状完全一致。经过多位点序列分型和BOX-PCR技术,以及LOPAT、GATTa和Ayers碳源利用试验等,确定该病害的病原菌为丁香假单胞流泪致病变种Pseudomonas syringae pv.lachrymans。以黄瓜细菌性茎枯萎病菌A2为供试菌株,黄瓜细菌性角斑病菌丁香假单胞菌流泪致病变种P.syringae pv.lachrymans pslb8为对照菌株,对其进行不同温度下致病力、体内和体外生长能力测定,结果表明:20℃条件下,A2菌株的致病力、体内和体外生长能力均强于pslb8菌株,相对低温的条件更有利于黄瓜细菌性茎枯萎病病原菌的侵染和病害的发生。

猕猴桃细菌性溃疡病菌的分离鉴定与致病性分析

溃疡病是猕猴桃主要细菌性病害,其病原为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)。文章利用不同猕猴桃种植园的溃疡病发病植株进行Psa菌株分离、鉴定及致病性分析;结果显示,获得了6个具有丁香假单胞菌形态特征的菌株,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定与序列同源比对,所分离菌株为Psa,该菌株在‘红阳’猕猴桃的接种检测中显示不同致病性,其中ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1接种植株出现溃疡病症状,而ScMbJ1、ScDjyH3、ScYaH2未表现显著致病性。烟草叶片超敏反应也显示它们具有不同的植物免疫系统激活能力。该研究获得了猕猴桃溃疡病分离菌株,其表型差异为后续的致病基因遗传分析奠定了基础。

黄瓜细菌性角斑病PMA-qPCR检测方法的建立和应用

黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于PMA染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同株的gap1基因序列,找出gap1基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物Dxf1和Dxr1,以其他5种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量PCR扩增,只有丁香假单胞菌有扩增曲线,证明引物非常特异。(2)以gap1基因为目的基因构建其克隆载体,将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养,使其大量复制。再将质粒提取,以提取的质粒作为标准品,根据其浓度将其稀释为5×101-5×107 7个梯度绘制标准曲线,获得的扩增效率为96.6%,并做组内重复和组间重复,变异系数均在2%内,证明标准曲线重复性良好。(3)将构建好的方法用于实际样品的检测,得到的Ct值为27.99,根据标准曲线所得的起始模板与Ct值之间的线性关系公式,检测到100 mg患病叶片中含有的菌体为7.69×102拷贝。研究表明,该方法可以快速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量,为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持。

猕猴桃细菌性溃疡病菌T3SS关键效应蛋白基因致病功能

【目的】由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是全球猕猴桃产业最具毁灭性的病害。病原细菌主要通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)将多种效应蛋白(T3SS effector,T3SE)注入寄主植物细胞,进而促进病菌侵染和致病。本研究旨在解析Psa基因组中T3SE的信息并对其T3SS和T3SE的致病功能进行系统分析,为溃疡病菌致病机制的研究和防治策略的制定提供依据。【方法】利用marker-free同源重组基因敲除技术获得M228菌株的T3SS功能缺陷突变体ΔhrcS和ΔhrcC,观察突变体在寄主上的致病力,同时检测突变体诱导本氏烟产生细胞坏死的情况;随后利用从Pseudomonas-Plant Interaction数据库下载的T3SE数据库,本地BLAST多序列比对构建强、弱致病菌株M228和M227的T3SE库,并对二者的T3SE基因信息进行比对分析;另外,获得M228菌株T3SE单、多效应子突变菌株20株及2株HopR1基因回补菌株(共涉及19个T3SE),并将各突变体室内有伤接菌猕猴桃枝条,系统评价各突变体致病力变化并进行统计分析。【结果】通过对Psa的hrcS和hrcC基因进行突变,证明T3SS是其在寄主上致病以及非寄主上过敏性坏死反应(HR)所必需的。通过数据库同源比对,发现在强毒株系和弱毒株系中有31个T3SE基因具有100%的同源性,选取一些基因进行缺失突变,发现hopM1/avrE1和hopR1是Psa重要的毒性因子,且二者不存在功能冗余。另外,单独敲除avrPto5或avrRpm1均能提高Psa致病力。在缺失A-F-E基因簇和avrPto5的菌株中,敲除hopM1/avrE1和hopR1也分别导致Psa的致病力显著下降;而同时敲除hopM1/avrE1、hopR1、avrPto5和A-F-E基因簇导致病菌完全丧失致病力。【结论】HopM1/AvrE1与同家族HopR1均为Psa重要致病因子,且独立于其他效应子发挥作用;avrPto5和avrRpm1基因缺失可以增强Psa的致病力。

拟南芥果胶甲酯化酶基因PME17在抵御丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株中的功能

细胞壁是植物抵御病原菌入侵的第一道屏障,果胶是细胞壁初生壁的主要组分。果胶甲酯化酶(PME)是修饰果胶的主要酶之一,它在合成细胞壁、调节其弹性和通透性等过程中发挥重要作用。拟南芥基因表达数据库显示,PME17等多个果胶甲酯化酶基因在病原菌侵染情况下强烈表达。本文研究了PME17的组织表达及其在丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株(Pst DC3000)侵染过程中的功能。结果表明,在未受Pst DC3000侵染的条件下,PME17基因在主根、根毛、子叶、叶毛、花粉等部位表达;在受Pst DC3000感染时,PME17表达显著增强。和野生型相比,pme17突变体对Pst DC3000侵染更加敏感,说明拟南芥PME17基因的表达受Pst DC3000的诱导,并在防御Pst DC3000侵染中起积极作用。

黄瓜细菌性流胶病的发生及防治

近几年,黄瓜细菌性流胶病危害严重,且发生普遍。生产试验表明,采取降低湿度,增强通风透光等农艺措施,定植前药剂处理土壤,定植时灌根和定植后药剂喷雾,对防治该病具有较好的效果。

黄瓜抗细菌性角斑病诱抗药剂的筛选及抗性机制研究

为筛选诱导黄瓜抗细菌性角斑病(angular leaf spot,ALS)的最佳诱抗药剂,选取11种商品诱抗剂,研究其室内诱导黄瓜抗细菌性角斑病的作用效果。结果显示11种诱抗剂的预处理均能有效提高黄瓜植株的长势,提高黄瓜对细菌性角斑病的抗性,表现为叶片病斑面积显著下降。其中药剂信号施康乐(SK)能有效减小叶片病斑面积,防效最好,而药剂顶花增瓜嫩直长(DH)处理的植株叶片病斑面积最大。为了进一步明确诱抗剂的作用机制,对诱抗剂SK和DH处理后的抗性相关基因SOD、SSU以及PR1-1a的相对表达量进行了初步分析。结果表明,SK和DH处理后3个基因的相对表达量均显著提高,SK处理的相对表达量显著高于DH处理。综上所述,合理施用信号施康乐可以诱导黄瓜幼苗提高对细菌性角斑病的抗性,对于黄瓜细菌性角斑病的早期预防和减少农药使用具有重要意义。

湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分离及其全基因组分析

通过了解湘西地区猕猴桃溃疡病致病菌分类地位和基因类型,初步探讨其致病的分子机理。采用纯培养法分离猕猴桃溃疡病菌;基于16S~23S rRNA基因内转录间隔序列进行病原菌的系统发育分析;通过基因组测序和生物信息学分析解析其致病的分子机理。从“米良1号”和“红阳”猕猴桃感病枝条中分离获得5株溃疡病菌,编号为L211、L212、L321、L322、L323;通过形态特征和16S~23S rRNA基因内转录间隔序列分析,鉴定5株细菌均为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)。以菌株L211为代表进行体外猕猴桃枝条接种实验表明能引起典型溃疡病症状。通过菌株L211的全基因组测序和生物信息学分析,获得5741条基因数目,长5412072 bp;基因功能注释发现菌株L211携带121种毒力因子、71个植物互作因子和77个耐药基因;同时,基因组单核苷酸多态性分析发现病原菌L211为基因Ⅲ型Psa。引起湘西地区猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因Ⅲ型,与国内外报道的引起猕猴桃溃疡病大流行的致病菌一致。猕猴桃溃疡病发病原因可能是病原菌的多种毒力基因和互作基因协同作用的结果。

猕猴桃溃疡病病原菌MLVA分型引物的筛选及验证

【目的】筛选出一组可精准快速地对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)进行分型的引物组合。【方法】针对前期文献已报道的34对引物,采用PCR技术验证该34对引物对中国Psa菌株的扩增效率及准确性;利用模拟PCR获取菌株串联重复(TR)数;以辛普森指数(Simpson’s index,SI)作为筛选引物组合的标准,基于R软件平台,筛选最优引物组合。【结果】34对引物对中国Psa扩增效果均良好,其中TR14与TR11II、TR19与Psa-01引物序列相同;TR8与Psa-08、TR39II与Psa-10、GM-1834与TR10I、GM-1553与TR64II、TR19Psa-01与TR19II扩增同一TR;Psa-09扩增产物串联重复单元长度不唯一,TR2II扩增产物侧翼变异较大,不能通过电泳确定串联重复数;最终确定SI值与全部引物组合相同的最低引物数量为9对,使用该9对引物的组合可将Psa已知的5种生物型准确分开。【结论】TR23/Psa-04、Psa-03、Psa-05、Psa-06、TR10IGM-1834、TR30I、TR1II、Psa-10TR39II、TR64IIGM-1553等9对引物可代表当前文献报道的34对引物,进行Psa分型研究,探索猕猴桃溃疡病的传播和流行规律,为病害防控策略的制定提供科学依据。