月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达,且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol.L-1IPTG诱导4 h后,携带RhEGS1 ORF的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。

北细辛丁香酚合成酶基因克隆及其表达分析

丁香酚合成酶(eugenol synthase,EGS)是北细辛(Asarum heterotropoides)主要活性成分甲基丁香酚体内合成途径中的关键酶之一。该研究根据北细辛转录组数据库中筛选到的序列设计特异引物,以RT-PCR法扩增获得北细辛丁香酚合成酶基因(AhEGS)的开放阅读框(ORF)序列,进行了相应的生物信息学分析。同时运用实时定量PCR法分析AhEGS在不同发育时期(幼叶期、花期、果期)和不同组织部位(叶、根茎、根)中的表达谱,并进行原核表达分析。结果显示:(1)AhEGS基因ORF序列长为951 bp,编码316个氨基酸,理论分子量为34.93 kD,等电点为6.19,AhEGS蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽序列;同源序列比对发现,北细辛AhEGS与月季RcEGS(AFQ98278.1)同源性最高。(2)实时定量PCR分析表明,AhEGS基因在北细辛幼叶期的根中表达量最高。(3)成功构建了原核表达载体pET28a-AhEGS-BL21,经pET28a-AhEGS重组子转化E.coli BL21(DE3),SDS-PAGE检测显示在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中诱导产生了35 kD左右的特异性蛋白,与理论分子量一致;最佳诱导条件为16℃、14 h,IPTG浓度为0.2 mmol/L。该研究首次克隆了北细辛的EGS基因,构建了原核表达载体,筛选出该蛋白最佳诱导条件,研究结果为北细辛甲基丁香酚代谢工程的应用奠定基础。

月季(Rosa chinensis)丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析

根据GenBank发表的丁香酚合成酶(EGS)基因的蛋白保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,从古老月季(Rosa chinensis)品种‘月月粉’盛开期的花瓣中获得了1个新的丁香酚合成酶基因RcEGS1,GenBank登录号为JQ522949。该基因全长为1171bp,开放阅读框(ORF)951bp,编码317个氨基酸;蛋白质理论分子量为35.64kD,等电点为7.36。氨基酸同源性分析表明,RcEGS1与矮牵牛PhIGS1的氨基酸同源性达到70%,与罗勒ObEGS1的同源性为59%,与月季RhEGS1的同源性仅为48.2%。运用实时荧光定量PCR法分析RcEGS1在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达,发现其在叶片和茎段中没有表达,在花瓣和萼片中有表达,在盛开期的花瓣中表达量最高。