七烯甲萘醌合成过程中关键蛋白的定位分析

七烯甲萘醌作为维生素K 2的重要亚型,在细胞中主要存在于细胞膜上,在氧化磷酸化的过程中起到电子载体的作用。作为七烯甲萘醌合成过程中的关键酶,1,4-二羟基-2-萘甲酸异戊二烯基转移酶(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid prenyltransferase,MenA)和甲基转移酶(methyltransferase,MenH)目前研究较少,其在细胞中的分布还未被研究,这也限制了七烯甲萘醌产量的进一步提高。该研究重点关注MenA和MenH在细胞内的分布问题,首先构建MenA、MenH和eGFP的融合蛋白,利用荧光定位的方法确定MenA和MenH在细胞中的定位。然后,使用表面活性剂Triton-100破坏细胞膜的结构,发现随着表面活性剂浓度的增加,七烯甲萘醌的合成受到明显抑制。该研究表明细胞膜结构的完整性是七烯甲萘醌合成的前提条件,并且揭示了七烯甲萘醌是在细胞膜上直接被合成,不是被转运到细胞膜中。研究结果为深入探索七烯甲萘醌合成机制提供了方向。

反相高效液相色谱法测定维生素K_2中七烯甲萘醌的含量

目的建立维生素K2产品中七烯甲萘醌(MK-7)的反相高效液相色谱定量检测的方法。方法采用Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为50%甲醇/水(含0.1%乙酸)(95:5=V:V),50%异丙烷。流速为等速1.0 m L/min,检测波长270 nm,柱温40℃。结果 MK-7在浓度0.355~2.132 mg/m L的范围内具有良好的线性关系,相关系数在0.9999以上。重复性实验中相对标准偏差为0.41%,加标回收率为98.15%。结论此方法准确性高、重现性好、操作简单,可用于维生素K2中MK-7含量测定。

高效液相色谱法测定多组分配方含维生素K2制剂中七烯甲萘醌的含量

目的建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定多组分配方含维生素K2制剂中七烯甲萘醌含量的方法。方法试样在酸化、酶解后,经异丙醇提取,采用反相色谱柱分离,紫外检测,外标法定量测定七烯甲萘醌含量。结果在优化的实验条件下,七烯甲萘醌在0.20~7.90μg/mL范围内线性关系良好(r^2>0.9995),方法的定量限为1.6μg/g,回收率94.55%~101.05%,相对标准偏差为2.33%(n=3)。结论该方法灵敏快速准确,适用于多组分配方制剂中七烯甲萘醌的含量检测。

高效液相色谱法测定乳粉中VK2（七烯甲萘醌）含量

建立使用高效液相色谱快速检测乳粉中VK2(七烯甲萘醌(menaquinone-7,MK-7))含量的方法。乳粉样品用250 mg/g脂肪酶酶解2 h,经500 mg/g碳酸钾皂化,正己烷提取,旋转蒸发浓缩,甲醇-异丙醇(4∶1,V/V)复溶,用C18色谱柱及还原柱柱后衍生,经高效液相色谱-荧光检测器测定,外标法定量。结果表明:MK-7在19.47 min附近出峰,标准曲线在MK-7质量浓度0.0~1.5μg/mL范围内呈良好线性关系(R^2=0.99995);空白乳粉样品中MK-7添加量为5、10、25μg/100 g时,加标回收率为87.9%~94.3%,相对标准偏差为0.9%~6.4%;取样量为2 g、定容体积为1 mL时,MK-7检测限为0.15μg/100 g,定量限为0.5μg/100 g。本检测方法前处理简单,具有较高准确度、灵敏度和稳定性,可以用于乳粉中VK2(MK-7)含量的检测。

高效液相色谱法测定保健食品中七烯甲萘醌

建立高效液相色谱法测定保健食品中七烯甲萘醌(MK-7)。含油脂类食品先经脂肪酶酶解,再经异丙醇提取,不含油食品直接使用异丙醇超声提取,采用高效液相紫外检测器进行检测。用Intersil ODS–3 C_(18)型色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以甲醇–异丙醇(体积比为75∶25)为流动相,流量为1.0 mL/min,检测波长为270 nm,柱温为40℃,进样体积为20μL。MK-7的质量浓度在0.4-20 mg/L的范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系,相关系数为0.9998,方法检出限为0.06 mg/L,定量限为0.2 mg/L。含油脂类食品与不含油脂类食品中MK-7平均加标回收率分别为96.2%、103.2%,测定结果的相对标准偏差分别为0.9%、1.0%(n=9)。室温下,MK-7样品溶液在24 h内稳定。该方法操作简单,可用于保健食品中MK-7的含量测定。

功能膜微域在七烯甲萘醌合成过程中的作用解析

功能膜微域(functional membrane microdomains,FMMs)是细菌细胞质膜上富含脚手架蛋白和聚异戊二烯类物质的结构域,参与细胞生命活动的多个过程。本研究主要聚焦于揭示FMMs与MK-7之间的相关性,并对MK-7合成进行代谢调控。首先,通过荧光标记初步确定FMMs和MK-7在细胞膜上存在相关性;其次通过分析FMMs破坏前后细胞膜上MK-7含量的变化以及细胞膜有序度的变化情况,明确MK-7是FMMs的聚异戊二烯类关键组分;接下来,采用可视化分析探究MK-7合成过程中部分关键酶的亚细胞定位,并通过FloA将胞内游离的途径酶Fni、IspA、HepT和YuxO定位至FMMs中,进而实现MK-7合成途径的区室化,最终成功获得一株高产MK-7的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株BS3AT,摇瓶水平MK-7产量达到300.3 mg/L,3 L发酵罐中MK-7产量为464.2 mg/L。

高效液相色谱法测定保健食品功效成分七烯甲萘醌含量

目的建立高效液相色谱法测定保健食品中维生素K_(2)类七烯甲萘醌(MK-7)的方法。方法样品用异丙醇提取后用高效液相色谱分析,经C18柱分离,以甲醇+异丙醇+0.1%乙酸水=485+500+15为流动相,二极管振列检测器(PDA)检测,外标法定量。结果该法检出限为0.02mg/kg,线性范围为0.50mg/L~10.00mg/L,相关系数为0.9997;加标回收率为95.0%~98.3%;重复性实验中相对标准偏差为2.4%。结论该法操作简便、准确可靠,适用于维生素K_(2)类MK-7含量测定。

高效液相色谱法测定复配营养强化剂维生素K_(2)的含量

建立高效液相色谱法测定复配营养强化剂中维生素K_(2)(七烯甲萘醌MK-7)的含量。本方法利用维生素K_(2)在波长248nm处有最大吸收,对样品进行甲醇分散,50℃提取,甲醇为流动相,高效液相色谱测定。结果表明:MK-7标准溶液峰面积与浓度有较好的线性关系;不同样品的精密度试验,相对标准偏差均小于5%,加标回收率均在95%~105%之间。此方法重复性好,准确度高,可用于复配营养强化剂中MK-7的测定。

高效液相色谱法测定维生素和矿物质复方制剂中维生素K_(2)含量

目的建立测定维生素和矿物质复方制剂中维生素K_(2)(七烯甲萘醌)含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为Thermo 30105-154630型ODS柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇,流速为1.0 mL/min,检测波长为254 nm,柱温为50℃,进样量为50μL。结果七烯甲萘醌的质量浓度在0~1.0μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(R^(2)=0.9999,n=5);检测限为0.12μg/g,定量限为0.36μg/g;精密度、稳定性试验结果的RSD均小于3%(n=6);平均加样回收率为99.33%,RSD为2.98%(n=9)。结论该方法操作简便、结果准确、稳定性好,可用于维生素和矿物质复方制剂中维生素K_(2)的含量测定。

高效液相色谱-荧光检测法测定食品中维生素K2的含量

建立了高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)同时快速分离检测猪肉、猪肝、纯牛奶、酸奶、黄油、鸡蛋、豆豉、纳豆8种食品中2种维生素K2的方法。样品经酶解、皂化、萃取、氮吹复溶处理后,用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm)分离,柱后锌粉还原柱(35 mm×4.6 mm)衍生,以甲醇(含有二氯甲烷10%、冰醋酸0.03%、氯化锌1.5 g/L、无水乙酸钠0.5 g/L)为流动相,进入荧光检测器进行检测。结果表明,四烯甲萘醌(Menatetrenone4,MK-4)、七烯甲萘醌(Menatetrenone7,MK-7)在15 min内分离出峰。2种维生素K2在各自的线性范围内关系良好,相关系数r=1.0000。当取样量为2 g,定容2 mL时,MK-4的检出限为0.01μg/100 g,定量限为0.04μg/100 g;MK-7的检出限为0.06μg/100 g,定量限为0.2μg/100 g。当取样量为10 g,定容2 mL时,MK-4的检出限为0.002μg/100 g,定量限为0.008μg/100 g;MK-7的检出限为0.012μg/100 g,定量限为0.04μg/100 g。精密度(RSD)均不超过3.56%,回收率为80.6%~95.5%。8种食品中,猪肉、纯牛奶、酸奶、黄油、鸡蛋中仅含有MK-4,其中纯牛奶中含量最低,仅为(0.34±0.02)μg/100 g,鸡蛋中含量最高,达(25.38±0.85)μg/100 g。猪肝、豆豉、纳豆中仅含MK-7,其中猪肝含量较低,为(25.45±0.83)μg/100 g,纳豆中含量最为丰富,高达(923.20±11.45)μg/100 g。该法准确、可靠、高效,可用于食品中维生素K2的高通量检测。

高效液相色谱法测定食品中维生素K_(1)和维生素K_(2)的含量

建立高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定食品中维生素K1和维生素K2含量的分析方法。方法:配方奶粉、酸奶、纳豆冻干粉和鸡胗冻干粉经酶解、异丙醇分散、正己烷萃取、旋转蒸发复溶后,使用Thermo Acclaim^(TM)120C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm)分离,锌粉还原柱(50 mm×4.6 mm)衍生,以900 mL甲醇:100 mL四氢呋喃(含冰醋酸0.3 mL,氯化锌1.5 g,无水乙酸钠0.5 g)为流动相,激发波长为243 nm,发射波长为430 nm,分离维生素K 1(Vitamin K 1,VK 1)、四烯甲萘醌(menaquinone-4,MK-4)、七烯甲萘醌(menaquinone-7,MK-7)和九烯甲萘醌(menaquinone-9,MK-9)。结果:VK 1、MK-4、MK-7和MK-9在20~1000μg/L范围内与峰面积有良好线性关系。配方奶粉、酸奶、纳豆冻干粉和鸡胗冻干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9含量的相对标准偏差(RSD)均小于5%,表明精密度好。配方奶粉、酸奶和纳豆冻干粉不同水平加标回收率分别为85.0%~107.8%、85.8%~109.6%、85.1%~102.7%,回收率的RSD均小于5%,表明回收率高,相对标准偏差小。结论:实验建立的方法重复性好、准确度高,可以精准定量食品中维生素K_(1)和维生素K_(2)的含量。

超高效液相色谱-二极管阵列检测法测定油基类保健食品中的维生素K2的含量

建立了超高效液相色谱-二极管阵列检测法(UPLC-PDA)测定油基类保健食品中维生素K 2(七烯甲萘醌)含量的方法。试验显示维生素K 2对紫外光、强碱条件敏感。样品经脂肪酶酶解后,皂化、萃取、复溶,C 18色谱柱(100×2.1 mm,1.7μm)分离,甲醇为流动相,流速为0.3 mL/min,254 nm检测。本法在1.0~20.0 mg/L线性关系良好,R 2=0.9999。当取样量为1 g,定容至10 mL时,方法LOD为1μg/g,LOQ为3μg/g,RSD为1.2%,加标回收率为98.7%~102.2%。该法准确、高效,对各类保健食品具有良好的普适性。

代谢工程改造枯草芽孢杆菌高效生产MK-7

七烯甲萘醌(MK-7)作为一种重要的K族维生素,在保健食品和医药制造领域具有良好的应用前景。为了得到一株高产MK-7菌株,作者以Bacillus subtilis 168为出发菌株,分别进行了代谢分支途径基因敲除、MK-7合成途径关键基因menA的突变体筛选优化、人工操纵子强化部分途径基因的表达来提升MK-7发酵产量。最终构建得到高产菌株MK7-13,发酵产MK-7达到(73.73±1.86)mg/L,与对照菌株相比提高了9.71倍,为后续微生物发酵法工业化生产MK-7奠定了基础。

在线固相萃取-高效液相色谱法快速测定奶粉中的维生素K_(1)与维生素K_(2)

目的 建立在线固相萃取-高效液相色谱法快速测定奶粉中维生素K_(1) (vitamin K_(1),VK_(1))、维生素K_(2)(vitamin K_(2,)VK_(2))含量的分析方法。方法 1 g奶粉样品中加入3 m L 0.13 g/m L脂肪酶水溶液,37℃恒温酶解脂肪,并用氢氧化钾的水-异丙醇混合溶液定容至25 m L,获得酶解液。使用在线固相萃取-高效液相色谱联用仪对酶解液进行自动化分析,其中以甲醇:水=20:80 (V:V)作为上样溶剂,甲醇作为清洗、除水溶剂,10%四氢呋喃甲醇作为转移溶剂与液相色谱流动相,Eclipse Plus C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5μm)作为分析柱,经过锌粉还原柱(50 mm×4.6 mm,70μm)衍生,采取荧光检测器进行检测,外标法定量,获得VK_(1)、VK_(2)含量。结果 VK_(1)、四烯甲萘醌(menaquinone-4,MK-4)、七烯甲萘醌(menaquinone-7,MK-7)在0.002~0.100μg/m L范围内线性良好;检出限分别为0.12、0.14、0.19μg/100 g,方法定量限为0.37、0.46、0.58μg/100 g。结论 该方法操作简便、快速、灵敏度高,稳定性良好,可作为婴幼儿奶粉质量控制、监督检查的快速检验方法。