禽副粘病毒-2膜融合相关多肽基因的构建与表达

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步. 禽副粘病毒-2 (APMV-2) 囊膜表面糖蛋白有2种,与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN) 及介导膜融合的融合糖蛋白(F). HN蛋白的茎部区域(stalk region) 与球状头部区域(globular head region) ,以及F蛋白的3段七肽重复区域(heptad repeat,HR) 都可能与膜融合直接相关,将5段多肽进行基因的构建与表达研究. 根据已发表的禽副粘病毒-1 (APMV-1) 氨基酸序列,应用BLAST程序进行同源性分析,以确定APMV-2相应区域,使用搭桥PCR或普通PCR方法构建基因,分别克隆入表达载体pGEX-6p-Ⅰ获得重组质粒,阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),表达后获得可溶性融合蛋白,3C蛋白酶酶切后的蛋白质混合物经Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化,最终获得可溶性、高纯度的5段多肽. 应用LearnCoil-VMF软件与ExPASy系列软件对蛋白质结构与功能进行预测与分析. 分子筛实验结果表明,F蛋白的HR1与HR2可形成六聚体结构,圆二色谱实验结果则表明,六聚体蛋白富含琢螺旋结构.

副黏病毒HN与F糖蛋白的结合作用域

副黏病毒囊膜表面糖蛋白有两种,即与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN)以及介导膜融合的融合糖蛋白(F).HN与受体的结合可激活F,使其发生构象变化,从而介导病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合,但HN与F蛋白相互结合的区域还不清楚.用基因工程方法获得禽副流感病毒-2(APIV-2)HN蛋白球状头部区域(globularheadregion,HNH)以及F蛋白两段七肽重复区域(heptadrepeat,HR)HR1与HR2三个纯化蛋白.蛋白质体外结合实验及质谱与圆二色谱的结果表明,HNH不仅可与HR2结合,还可与HR1结合,并且结合后的蛋白构象与各组成多肽的构象不同.结果表明,HNH可能是HN蛋白与F蛋白的结合作用域.在此基础上讨论了HN激活F并引致膜融合的分子机制,可为阻止病毒膜融合寻找新策略.